Пост код 00 что делать. Новое поколение POST-карт

МОДУЛЬ 1 СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ

МОДУЛЬ 1 СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ

Структура модуля	Темы
Модульная единица 1	1.1. Структурная организация белков. Этапы формирования нативной конформации белков 1.2. Основы функционирования белков. Лекарства как лиганды, влияющие на функцию белков 1.3. Денатурация белков и возможность их спонтанной ренативации
Модульная единица 2	1.4. Особенности строения и функционирования олигомерных белков на примере гемоглобина 1.5. Поддержание нативной конформации белков в условиях клетки 1.6. Многообразие белков. Семейства белков на примере иммуноглобулинов 1.7. Физико-химические свойства белков и методы их разделения

Модульная единица 1 СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ МОНОМЕРНЫХ БЕЛКОВ И ОСНОВЫ ИХ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ

Цели изучения Уметь:

1. Использовать знания об особенностях структуры белков и зависимости функций белков от их структуры для понимания механизмов развития наследственных и приобретенных протеинопатий.

2. Объяснять механизмы лечебного действия некоторых лекарств как лигандов, взаимодействующих с белками и изменяющих их активность.

3. Использовать знания о строении и конформационной лабильности белков для понимания их структурно-функциональной неустойчивости и склонности к денатурации в изменяющихся условиях.

4. Объяснять применение денатурирующих агентов в качестве средств для стерилизации медицинского материала и инструментов, а также в качестве антисептиков.

Знать:

1. Уровни структурной организации белков.

2. Значение первичной структуры белков, определяющей их структурное и функциональное многообразие.

3. Механизм формирования в белках активного центра и его специфическое взаимодействие с лигандом, лежащее в основе функционирования белков.

4. Примеры влияния экзогенных лигандов (лекарств, токсинов, ядов) на конформацию и функциональную активность белков.

5. Причины и следствия денатурации белков, факторы, вызывающие денатурацию.

6. Примеры использования денатурирующих факторов в медицине в качестве антисептиков и средств для стерилизации медицинских инструментов.

ТЕМА 1.1. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВ. ЭТАПЫ ФОРМИРОВАНИЯ НАТИВНОЙ

КОНФОРМАЦИИ БЕЛКОВ

Белки - это полимерные молекулы, мономерами которых являются всего 20 α-аминокислот. Набор и порядок соединения аминокислот в белке определяется строением генов в ДНК индивидумов. Каждый белок в соответствии с его специфической структурой выполняет свойственную ему функцию. Набор белков данного организма определяет его фенотипические особенности, а также наличие наследственных болезней или предрасположенность к их развитию.

1. Аминокислоты, входящие в состав белков. Пептидная связь. Белки - полимеры, построенные из мономеров - 20 α-аминокислот, общая формула которых

Аминокислоты различаются по строению, размерам, физико-химическим свойствам радикалов, присоединенных к α-углеродному атому. Функциональные группы аминокислот определяют особенности свойств разных α-аминокислот. Встречающиеся в α-аминокислотах радикалы можно разделить на несколько групп:

Пролин, в отличие от других 19 мономеров белков, не аминокислота, а иминокислота, радикал в пролине связан как с α-углеродным атомом, так и с иминогруппой

Аминокислоты различаются по растворимости в воде. Это связано со способностью радикалов взаимодействовать с водой (гидратироваться).

К гидрофильным относятся радикалы, содержащие анионные, катионные и полярные незаряженные функциональные группы.

К гидрофобным относятся радикалы, содержащие метильные группы, алифатические цепи или циклы.

2. Пептидные связи соединяют аминокислоты в пептиды. При синтезе пептида α-карбоксильная группа одной аминокислоты взаимодействует с α-аминогруппой другой аминокислоты с образованием пептидной связи:

Белки представляют собой полипептиды, т.е. линейные полимеры α-аминокислот, соединенных пептидной связью (рис. 1.1.)

Рис. 1.1. Термины, используемые при описании строения пептидов

Мономеры аминокислот, входящих в состав полипептидов, называются аминокислотными остатками. Цепь повторяющихся групп -NH-CH-CO - образует пептидный остов. Аминокислотный остаток, имеющий свободную α-аминогруппу, называется N-концевым, а имеющий свободную α-карбоксильную группу - С-концевым. Пептиды записывают и читают с N-конца к С-концу.

Пептидная связь, образуемая иминогруппой пролина, отличается от других пептидных связей: у атома азота пептидной группы отсутствует водород,

вместо него имеется связь с радикалом, в результате одна сторона цикла включается в пептидный остов:

Пептиды различаются аминокислотным составом, количеством аминокислот и порядком соединения аминокислот, например, Сер-Ала-Глу-Гис и Гис-Глу-Ала-Сер - два разных пептида.

Пептидные связи очень прочные, и для их химического неферментативного гидролиза требуются жесткие условия: анализируемый белок гидролизуют в концентрированной соляной кислоте при температуре около 110° в течение 24 часов. В живой клетке пептидные связи могут разрываться с помощью протеолитических ферментов, называемых протеазами или пептидгидролазами.

3. Первичная структура белков. Аминокислотные остатки в пептидных цепях разных белков чередуются не случайным образом, а расположены в определенном порядке. Линейная последовательность или порядок чередования аминокислотных остатков в полипептидной цепи называется первичной структурой белка.

Первичная структура каждого индивидуального белка закодирована в молекуле ДНК (в участке, называемом геном) и реализуется в ходе транскрипции (переписывания информации на мРНК) и трансляции (синтез первичной структуры белка). Следовательно, первичная структура белков индивидуального человека - наследственно передаваемая от родителей детям информация, определяющая особенности строения белков данного организма, от которых зависит функция имеющихся белков (рис. 1.2.).

Рис. 1.2. Взаимосвязь между генотипом и конформацией белков, синтезирующихся в организме индивидума

Каждый из примерно 100 000 индивидуальных белков в организме человека имеет уникальную первичную структуру. В молекулах одного типа белка (например, альбумина) одинаковое чередование аминокислотных остатков, что отличает альбумин от любого другого индивидуального белка.

Последовательность аминокислотных остатков в пептидной цепи можно рассматривать как форму записи информации. Эта информация определяет пространственную укладку линейной пептидной цепи в более компактную трехмерную структуру, называемую конформацией белка. Процесс формирования функционально активной конформации белка носит название фолдинг.

4. Конформация белков. Свободное вращение в пептидном остове возможно между атомом азота пептидной группы и соседним α-углеродным атомом, а также между α-углеродным атомом и углеродом карбонильной группы. Вследствие взаимодействия функциональных групп аминокислотных остатков первичная структура белков может приобретать более сложные пространственные структуры. В глобулярных белках различают два основных уровня укладки конформации пептидных цепей: вторичную и третичную структуры.

Вторичная структура белков - это пространственная структура, формирующаяся в результате образования водородных связей между функциональными группами -С=О и - NH- пептидного остова. При этом пептидная цепь может приобретать регулярные структуры двух типов: α-спирали и β-структуры.

В α-спирали водородные связи образуются между атомом кислорода карбонильной группы и водородом амидного азота 4-й от него аминокислоты; боковые цепи аминокислотных остатков

располагаются по периферии спирали, не участвуя в образовании вторичной структуры (рис. 1.3.).

Объемные радикалы или радикалы, несущие одинаковые заряды, препятствуют формированию α-спирали. Остаток пролина, имеющий кольцевую структуру, прерывает α-спираль, так как из-за отсутствия водорода у атома азота в пептидной цепи невозможно образовать водородную связь. Связь между азотом и α-углеродным атомом входит в состав цикла пролина, поэтому пептидный остов в этом месте приобретает изгиб.

β-Структура формируется между линейными областями пептидного остова одной полипептидной цепи, образуя при этом складчатые структуры. Полипептидные цепи или их части могут формировать параллельные или антипараллельные β-структуры. В первом случае N- и С-концы взаимодействующих пептидных цепей совпадают, а во втором - имеют противоположное направление (рис. 1.4).

Рис. 1.3. Вторичная структура белка - α-спираль

Рис. 1.4. Параллельные и антипараллельные β-складчатые структуры

β-структуры обозначены широкими стрелками: А - Антипараллельная β-структура. Б - Параллельные β-складчатые структуры

В некоторых белках β-структуры могут формироваться за счет образования водородных связей между атомами пептидного остова разных полипептидных цепей.

В белках также встречаются области с нерегулярной вторичной структурой, к которым относят изгибы, петли, повороты полипептидного остова. Они часто располагаются в местах, где меняется направление пептидной цепи, например, при формировании параллельной β-складчатой структуры.

По наличию α-спиралей и β-структур глобулярные белки могут быть разделены на четыре категории.

Рис. 1.5. Вторичная структура миоглобина (А) и β-цепи гемоглобина (Б), содержащие восемь α-спиралей

Рис. 1.6. Вторичная структура триозофосфатизомеразы и домена пируваткиназы

Рис. 1.7. Вторичная структура константного домена иммуноглобулина (А) и фермента супероксиддисмутазы (Б)

В четвертую категорию включены белки, имеющие в своем составе незначительное количество регулярных вторичных структур. К таким белкам можно отнести небольшие, богатые цистеином белки или металлопротеины.

Третичная структура белка - тип конформации, образующийся за счет взаимодействий между радикалами аминокислот, которые могут находиться на значительном расстоянии друг от друга в пептидной цепи. Большинство белков при этом формируют пространственную структуру, напоминающую глобулу (глобулярные белки).

Так как гидрофобные радикалы аминокислот имеют тенденцию к объединению с помощью так называемых гидрофобных взаимодействий и межмолекулярных ван-дер-ваальсовых сил, внутри белковой глобулы образуется плотное гидрофобное ядро. Гидрофильные ионизированные и неионизированные радикалы в основном располагаются на поверхности белка и определяют его растворимость в воде.

Рис. 1.8. Типы связей, возникающих между радикалами аминокислот при формировании третичной структуры белка

1 - ионная связь - возникает между положительно и отрицательно заряженными функциональными группами;

2 - водородная связь - возникает между гидрофильной незаряженной и любой другой гидрофильной группой;

3 - гидрофобные взаимодействия - возникают между гидрофобными радикалами;

4 - дисульфидная связь - формируется за счет окисления SH-групп остатков цистеина и их взаимодействия друг с другом

Гидрофильные аминокислотные остатки, оказавшиеся внутри гидрофобного ядра, могут взаимодействовать друг с другом с помощью ионных и водородных связей (рис. 1.8).

Ионные и водородные связи, а также гидрофобные взаимодействия относятся к числу слабых: их энергия ненамного превышает энергию теплового движения молекул при комнатной температуре. Конформация белка поддерживается за счет возникновения множества таких слабых связей. Так как атомы, из которых состоит белок, находятся в постоянном движении, то возможен разрыв одних слабых связей и образование других, что приводит к небольшим перемещениям отдельных участков полипептидной цепи. Это свойство белков изменять конформацию в результате разрыва одних и образования других слабых связей называется конформационной лабильностью.

В организме человека функционируют системы, поддерживающие гомеостаз - постоянство внутренней среды в определенных допустимых для здорового организма пределах. В условиях гомеостаза небольшие изменения конформации не нарушают общую структуру и функцию белков. Функционально активная конформация белка называется нативной конформацией. Изменение внутренней среды (например, концентрации глюкозы, ионов Са, протонов и т.д.) приводит к изменению конформации и нарушению функций белков.

Третичная структура некоторых белков стабилизирована дисульфидными связями, образующимися за счет взаимодействия -SH групп двух остатков

Рис. 1.9. Образование дисульфидной связи в молекуле белка

цистеина (рис. 1.9). Большинство внутриклеточных белков не имеет в третичной структуре ковалентных дисульфидных связей. Их наличие характерно для секретируемых клеткой белков, что обеспечивает их большую стабильность во внеклеточных условиях. Так, дисульфидные связи имеются в молекулах инсулина и иммуноглобулинов.

Инсулин - белковый гормон, синтезирующийся в β-клетках поджелудочной железы и секретируемый в кровь в ответ на повышение концентрации глюкозы в крови. В структуре инсулина имеются две дисульфидные связи, соединяющие полипептидные А- и В-цепи, и одна дисульфидная связь внутри А-цепи (рис. 1.10).

Рис. 1.10. Дисульфидные связи в структуре инсулина

5. Супервторичная структура белков. В разных по первичной структуре и функциям белках иногда выявляются сходные сочетания и взаиморасположение вторичных структур, которые называются супервторичной структурой. Она занимает промежуточное положение между вторичной и третичной структурами, поскольку это специфическое сочетание элементов вторичной структуры при формировании третичной структуры белка. Супервторичные структуры имеют специфические названия, такие как «α-спираль-поворот-а-спираль», «лейциновая застежка молния», «цинковые пальцы» и др. Такие супервторичные структуры характерны для ДНК-связывающих белков.

«Лейциновая застежка-молния». Этот вид супервторичной структуры используется для соединения двух белков. На поверхности взаимодействующих белков имеются α-спиральные участки, содержащие не менее четырех остатков лейцина. Лейциновые остатки в α-спирали располагаются через шесть аминокислот один от другого. Так как каждый виток α-спирали содержит 3,6 аминокислотных остатка, радикалы лейцина находятся на поверхности каждого второго витка. Лейциновые остатки α-спирали одного белка могут взаимодействовать с лейциновыми остатками другого белка (гидрофобные взаимодействия), соединяя их вместе (рис. 1.11.). Многие ДНК связывающие белки функционируют в составе олигомерных комплексов, где отдельные субъединицы связываются друг с другом «лейциновыми застежками».

Рис. 1.11. «Лейциновая застежка-молния» между α-спиральными участками двух белков

Примером таких белков могут служить гистоны. Гистоны - ядерные белки, в состав которых входит большое количество положительно заряженных аминокислот - аргинина и лизина (до 80%). Молекулы гистонов объединяются в олигомерные комплексы, содержащие восемь мономеров с помощью «лейциновых застежек», несмотря на значительный одноименный заряд этих молекул.

«Цинковый палец» - вариант супервторичной структуры, характерный для ДНК-связывающих белков, имеет вид вытянутого фрагмента на поверхности белка и содержит около 20 аминокислотных остатков (рис. 1.12). Форму «вытянутого пальца» поддерживает атом цинка, связанный с радикалами четыре аминокислот - двух остатков цистеина и двух - гистидина. В некоторых случаях вместо остатков гистидина находятся остатки цистеина. Два близко лежащих остатка цистеина отделены от двух других остатков Гисили Циспоследовательностью, состоящей примерно из 12 аминокислотных остатков. Этот участок белка образует α-спираль, радикалы которой могут специфично связываться с регуляторными участками большой бороздки ДНК. Специфичность связывания индивидуального

Рис. 1.12. Первичная структура участка ДНК-связывающих белков, формирующих структуру «цинкового пальца» (буквами обозначены аминокислоты, входящие в состав этой структуры)

регуляторного ДНК-связывающего белка зависит от последовательности аминокислотных остатков, расположенных в области «цинкового пальца». Такие структуры содержат, в частности, рецепторы стероидных гормонов, участвующих в регуляции транскрипции (считывание информации с ДНК на РНК).

ТЕМА 1.2. ОСНОВЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ БЕЛКОВ. ЛЕКАРСТВА КАК ЛИГАНДЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ФУНКЦИЮ БЕЛКОВ

1. Активный центр белка и его взаимодействие с лигандом. В процессе формирования третичной структуры на поверхности функционально активного белка, обычно в углублении, образуется участок, сформированный радикалами аминокислот, далеко стоящими друг от друга в первичной структуре. Этот участок, имеющий уникальное строение для данного белка и способный специфично взаимодействовать с определенной молекулой или группой похожих молекул, называется центром связывания белка с лигандом или активным центром. Лигандами называются молекулы, взаимодействующие с белками.

Высокая специфичность взаимодействия белка с лигандом обеспечивается комплементарностью структуры активного центра структуре лиганда.

Комплементарность - это пространственное и химическое соответствие взаимодействующих поверхностей. Активный центр должен не только пространственно соответствовать входящему в него лиганду, но и между функциональными группами радикалов, входящих в активный центр, и лигандом должны образоваться связи (ионные, водородные, а также гидрофобные взаимодействия), которые удерживают лиганд в активном центре (рис. 1.13).

Рис. 1.13. Комплементарное взаимодействие белка с лигандом

Некоторые лиганды, присоединяясь к активному центру белка, выполняют вспомогательную роль в функционировании белков. Такие лиганды называются кофакторами, а белки, имеющие в своем составе небелковую часть, - сложными белками (в отличие от простых белков, состоящих только из белковой части). Небелковая часть, прочно соединенная с белком, носит название простетической группы. Например, в составе миоглобина, гемоглобина и цитохромов содержится прочно прикрепленная к активному центру простетическая группа - гем, содержащий ион железа. Сложные белки, содержащие гем, называются гемопротеинами.

При присоединении к белкам специфических лигандов проявляется функция этих белков. Так, альбумин - важнейший белок плазмы крови - проявляет свою транспортную функцию, присоединяя к активному центру гидрофобные лиганды, такие как жирные кислоты, билирубин, некоторые лекарства и др. (рис. 1.14)

Лигандами, взаимодействующими с трехмерной структурой пептидной цепи, могут быть не только низкомолекулярные органические и неорганические молекулы, но и макромолекулы:

ДНК (рассмотренные выше примеры с ДНК-связывающими белками);

Полисахариды;

Рис. 1.14. Взаимосвязь генотипа и фенотипа

Уникальная первичная структура белков человека, закодированная в молекуле ДНК, в клетках реализуется в виде уникальной конформации, структуры активного центра и функций белков

В этих случаях белок узнает определенный участок лиганда, соразмерный и комплементарный центру связывания. Так на поверхности гепатоцитов имеются белки-рецепторы к гормону инсулину, имеющему также белковое строение. Взаимодействие инсулина с рецептором вызывает изменение его конформации и активации сигнальных систем, приводящих к запасанию в гепатоцитах питательных веществ после еды.

Таким образом, в основе функционирования белков лежит специфическое взаимодействие активного центра белка с лигандом.

2. Доменная структура и ее роль в функционировании белков. Длинные полипептидные цепи глобулярных белков часто складываются в несколько компактных, относительно независимых областей. Они имеют самостоятельную третичную структуру, напоминающую таковую у глобулярных белков, и называются доменами. Благодаря доменной структуре белков легче формируется их третичная структура.

В доменных белках центры связывания с лигандом часто располагаются между доменами. Так, трипсин - протеолитический фермент, который вырабатывается экзокринной частью поджелудочной железы и необходим для переваривания белков пищи. Он имеет двухдоменное строение, а центр связывания трипсина с его лигандом - пищевым белком - располагается в бороздке между двумя доменами. В активном центре создаются условия, необходимые для эффективного связывания специфического участка пищевого белка и гидролиза его пептидных связей.

Разные домены в белке при взаимодействии активного центра с лигандом могут перемещаться друг относительно друга (рис. 1.15).

Гексокиназа - фермент, катализирующий фосфорилирование глюкозы с помощью АТФ. Активный центр фермента располагается в расщелине между двумя доменами. При связывании гексокиназы с глюкозой окружающие ее домены смыкаются и субстрат оказывается в «ловушке», где и происходит фосфорилирование (см. рис. 1.15).

Рис. 1.15. Связывание доменов гексокиназы с глюкозой

В некоторых белках домены выполняют самостоятельные функции, связываясь с различными лигандами. Такие белки называются многофункциональными.

3. Лекарства - лиганды, влияющие на функцию белков. Взаимодействие белков с лигандами специфично. Однако благодаря конформационной лабильности белка и его активного центра можно подобрать другое вещество, которое также могло бы взаимодействовать с белком в активном центре или ином участке молекулы.

Вещество, по структуре похожее на природный лиганд, называют структурным аналогом лиганда или неприродным лигандом. Оно также взаимодействует с белком в активном центре. Структурный аналог лиганда может как усиливать функцию белка (агонист), так и снижать ее (антагонист). Лиганд и его структурные аналоги конкурируют друг с другом за связывание с белком в одном центре. Такие вещества называются конкурентными модуляторами (регуляторами) белковых функций. Многие лекарственные препараты действуют как ингибиторы белков. Некоторые из них получают химической модификацией природных лигандов. Ингибиторы белковых функций могут быть лекарствами и ядами.

Атропин - конкурентный ингибитор М-холинорецепторов. Ацетилхолин - нейромедиатор передачи нервного импульса через холинэргические синапсы. Для проведения возбуждения выделившийся в синаптическую щель ацетилхолин должен взаимодействовать с белком - рецептором постсинаптической мембраны. Обнаружены два типа холинорецепторов:

М-рецептор, кроме ацетилхолина избирательно взаимодействующий с мускарином (токсином мухомора). М - холинорецепторы имеются на гладких мышцах и при взаимодействии с ацетилхолином вызывают их сокращение;

Н-рецептор, специфично связывающийся с никотином. Н-холинорецепторы обнаружены в синапсах поперечнополосатых скелетных мышц.

Специфическим ингибитором М-холинорецепторов является атропин. Он содержится в растениях красавке и белене.

Атропин имеет в структуре схожие с ацетилхолином функциональные группы и их пространственное расположение, поэтому относится к конкурентным ингибиторам М-холинорецепторов. Учитывая, что связывание ацетилхолина с М-холинорецепторами вызывает сокращение гладких мышц, атропин используют как лекарство, снимающее их спазм (спазмолитик). Так, известно применение атропина для расслабления глазных мышц при просмотре глазного дна, а также для снятия спазмов при желудочнокишечных коликах. М-холинорецепторы имеются и в центральной нервной системе (ЦНС), поэтому большие дозы атропина могут вызвать нежелательную реакцию со стороны ЦНС: двигательное и психическое возбуждение, галлюцинации, судороги.

Дитилин - конкурентный агонист Н-холинорецепторов, ингибирующий функцию нервно-мышечных синапсов.

Нервно-мышечные синапсы скелетных мышц содержат Н-холинорецепторы. Их взаимодействие с ацетилхолином приводит к мышечным сокращениям. При некоторых хирургических операциях, а также в эндоскопических исследованиях используют препараты, вызывающие расслабление скелетных мышц (миорелаксанты). К ним относится дитилин, являющийся структурным аналогом ацетилхолина. Он присоединяется к Н-холинорецепторам, но в отличие от ацетилхолина очень медленно разрушается ферментом - ацетилхолинэстеразой. В результате длительного открытия ионных каналов и стойкой деполяризации мембраны нарушается проведение нервного импульса и происходит мышечное расслабление. Первоначально эти свойства были обнаружены у яда кураре, поэтому такие препараты называют курареподобными.

ТЕМА 1.3. ДЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКОВ И ВОЗМОЖНОСТЬ ИХ СПОНТАННОЙ РЕНАТИВАЦИИ

1. Так как нативная конформация белков поддерживается за счет слабых взаимодействий, изменение состава и свойств окружающей белок среды, воздействие химических реагентов и физических факторов вызывают изменение их конформации (свойство конформационной лабильности). Разрыв большого количества связей приводит к разрушению нативной конформации и денатурации белков.

Денатурация белков - это разрушение их нативной конформации под действием денатурирующих агентов, вызванное разрывом слабых связей, стабилизирующих пространственную структуру белка. Денатурация сопровождается разрушением уникальной трехмерной структуры и активного центра белка и потерей его биологической активности (рис. 1.16).

Все денатурированные молекулы одного белка приобретают случайную конформацию, отличающуюся от других молекул того же белка. Радикалы аминокислот, формирующие активный центр, оказываются пространственно удаленными друг от друга, т.е. разрушается специфический центр связывания белка с лигандом. При денатурации первичная структура белков остается неизменной.

Применение денатурирующих агентов в биологических исследованиях и медицине. В биохимических исследованиях перед определением в биологическом материале низкомолекулярных соединений обычно из раствора вначале удаляют белки. Для этой цели чаще всего используют трихлоруксусную кислоту (ТХУ). После добавления ТХУ в раствор денатурированные белки выпадают в осадок и легко удаляются фильтрованием (табл. 1.1.)

В медицине денатурирующие агенты часто применяют для стерилизации медицинского инструмента и материала в автоклавах (денатурирующий агент - высокая температура) и в качестве антисептиков (спирт, фенол, хлорамин) для обработки загрязненных поверхностей, содержащих патогенную микрофлору.

2. Спонтанная ренативация белков - доказательство детерминированности первичной структуры, конформации и функции белков. Индивидуальные белки - это продукты одного гена, которые имеют идентичную аминокислотную последовательность и в клетке приобретают одинаковую конформацию. Фундаментальный вывод о том, что в первичной структуре белка уже заложена информация о его конформации и функции, был сделан на основе способности некоторых белков (в частности, рибонуклеазы и миоглобина) к спонтанной ренативации - восстановлению их нативной конформации после денатурации.

Формирование пространственных структур белка осуществляется способом самосборки - самопроизвольного процесса, при котором полипептидная цепь, имеющая уникальную первичную структуру, стремится принять в растворе конформацию с наименьшей свободной энергией. Способность к ренативации белков, сохраняющих после денатурации первичную структуру, описана в опыте с ферментом рибонуклеазой.

Рибонуклеаза - фермент, разрушающий связи между отдельными нуклеотидами в молекуле РНК. Этот глобулярный белок имеет одну полипептидную цепь, третичная структура которой стабилизирована множеством слабых и четырьмя дисульфидными связями.

Обработка рибонуклеазы мочевиной, разрушающей водородные связи в молекуле, и восстановителем, разрывающим дисульфидные связи, приводит к денатурации фермента и потере его активности.

Удаление денатурирующих агентов диализом приводит к восстановлению конформации и функции белка, т.е. к ренативации. (рис. 1.17).

Рис. 1.17. Денатурация и ренативация рибонуклеазы

А - нативная конформация рибонуклеазы, в третичной структуре которой имеются четыре дисульфидные связи; Б - денатурированная молекула рибонуклеазы;

В - ренативированная молекула рибонуклеазы с восстановленной структурой и функцией

1. Заполните таблицу 1.2.

Таблица 1.2. Классификация аминокислот по полярности радикалов

2. Напишите формулу тетрапептида:

Асп - Про - Фен - Лиз

а) выделите в пептиде повторяющиеся группы, образующие пептидный остов, и вариабельные группы, представленные радикалами аминокислот;

б) обозначьте N- и С-концы;

в) подчеркните пептидные связи;

г) напишите другой пептид, состоящий из тех же аминокислот;

д) подсчитайте количество возможных вариантов тетрапептида с аналогичным аминокислотным составом.

3. Объясните роль первичной структуры белков на примере сравнительного анализа двух сходных по структуре и эволюционно близких пептидных гормонов нейрогипофиза млекопитающих - окситоцина и вазопрессина (табл. 1.3).

Таблица 1.3. Структура и функции окситоцина и вазопрессина

Для этого:

а) сравните состав и последовательность аминокислот двух пептидов;

б) найдите сходство первичной структуры двух пептидов и сходство их биологического действия;

в) найдите различия в структуре двух пептидов и различие их функций;

г) сделайте вывод о влиянии первичной структуры пептидов на их функции.

4. Опишите основные этапы формирования конформации глобулярных белков (вторичная, третичная структуры, понятие о супервторичной структуре). Укажите типы связей, участвующих в формировании структур белка. Радикалы каких аминокислот могут участвовать в образовании гидрофобных взаимодействий, ионных, водородных связях.

Приведите примеры.

5. Дайте определение понятию «конформационная лабильность белков», укажите причины ее существования и значение.

6. Раскройте смысл следующей фразы: «В основе функционирования белков лежит их специфическое взаимодействие с лигандом», используя термины и объясняя их значение: конформация белка, активный центр, лиганд, комплементарность, функция белка.

7. На одном из примеров объясните, что такое домены и какова их роль в функционировании белков.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Установите соответствие.

Функциональная группа в радикале аминокислоты:

А. Карбоксильная группа Б. Гидроксильная группа В Гуанидиновая группа Г. Тиольная группа Д. Аминогруппа

2. Выберите правильные ответы.

Аминокислоты с полярными незаряженными радикалами - это:

A. Цис Б. Асн

B. Глу Г. Три

3. Выберите правильные ответы.

Радикалы аминокислот:

A. Обеспечивают специфичность первичной структуры Б. Участвуют в формировании третичной структуры

B. Располагаясь на поверхности белка, влияют на его растворимость Г. Формируют активный центр

Д. Участвуют в образовании пептидных связей

4. Выберите правильные ответы.

Гидрофобные взаимодействия могут образовываться между радикалами аминокислот:

A. Тре Лей Б. Про Три

B. Мет Иле Г. Тир Ала Д. Вал Фен

5. Выберите правильные ответы.

Ионные связи могут образовываться между радикалами аминокислот:

A. Глн Асп Б. Apr Лиз

B. Лиз Глу Г. Гис Асп Д. Асн Apr

6. Выберите правильные ответы.

Водородные связи могут образовываться между радикалами аминокислот:

A. Сер Глн Б. Цис Тре

B. Асп Лиз Г. Глу Асп Д. Асн Тре

7. Установите соответствие.

Тип связи, участвующий в формировании структуры белка:

A. Первичная структура Б. Вторичная структура

B. Третичная структура

Г. Супервторичная структура Д. Конформация.

1. Водородные связи между атомами пептидного остова

2. Слабые связи между функциональными группами радикалов аминокислот

3. Связи между α-амино и α-карбоксильными группами аминокислот

8. Выберите правильные ответы. Трипсин:

A. Протеолитический фермент Б. Содержит два домена

B. Гидролизирует крахмал

Г. Активный центр расположен между доменами. Д. Состоит из двух полипептидных цепей.

9. Выберите правильные ответы. Атропин:

A. Нейромедиатор

Б. Структурный аналог ацетилхолина

B. Взаимодействует с Н-холинорецепторами

Г. Усиливает проведение нервного импульса через холинэргические синапсы

Д. Конкурентный ингибитор М-холинорецепторов

10. Выберите правильные утверждения. В белках:

A. Первичная структура содержит информацию о строении его активного центра

Б. Активный центр формируется на уровне первичной структуры

B. Конформация жестко фиксирована ковалентными связями

Г. Активный центр может взаимодействовать с группой похожих лигандов

благодаря конформационной лабильности белков Д. Изменение окружающей среды, может влиять на сродство активного

центра к лиганду

1. 1-В, 2-Г, 3-Б.

3. А, Б, В, Г.

7. 1-Б, 2-Д, 3-А.

8. А, Б, В, Г.

ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ И ПОНЯТИЯ

1. Белок, полипептид, аминокислоты

2. Первичная, вторичная, третичная структуры белка

3. Конформация, нативная конформация белка

4. Ковалентные и слабые связи в белке

5. Конформационная лабильность

6. Активный центр белка

7. Лиганды

8. Фолдинг белков

9. Структурные аналоги лигандов

10. Доменные белки

11. Простые и сложные белки

12. Денатурация белка, денатурирующие агенты

13. Ренативация белков

Решите задачи

«Структурная организация белков и основы их функционирования»

1. Основная функция белка - гемоглобина А (НвА) - транспорт кислорода к тканям. В популяции людей известны множественные формы этого белка с измененными свойствами и функцией - так называемые аномальные гемоглобины. Например, установлено, что гемоглобин S, обнаруженный в эритроцитах больных серповидно-клеточной анемией (HbS), имеет низкую растворимость в условиях низкого парциального давления кислорода (как это имеет место в венозной крови). Это приводит к образованию агрегатов данного белка. Белок утрачивает свою функцию, выпадает в осадок, а эритроциты приобретают неправильную форму (некоторые из них образуют форму серпа) и быстрее обычного разрушаются в селезенке. В результате развивается серповидноклеточная анемия.

Единственное различие в первичной структуре НвА и обнаружено в N-концевом участке β-цепи гемоглобина. Сравните N-концевые участки β-цепи и покажите, как изменения в первичной структуре белка влияют на его свойства и функции.

Для этого:

а) напишите формулы аминокислот, по которым различаются НвА и сравните свойства этих аминокислот (полярность, заряд).

б) сделайте вывод о причине снижения растворимости и нарушении транспорта кислорода в ткани.

2. На рисунке представлена схема строения белка, имеющего центр связывания с лигандом (активный центр). Объясните, почему белок обладает избирательностью в выборе лиганда. Для этого:

а) вспомните, что такое активный центр белка, и рассмотрите строение активного центра белка, представленного на рисунке;

б) напишите формулы радикалов аминокислот, входящих в состав активного центра;

в) нарисуйте лиганд, который мог бы специфически взаимодействовать с активным центром белка. Укажите на нем функциональные группы, способные образовать связи с радикалами аминокислот, входящих в состав активного центра;

г) укажите типы связей, возникающих между лигандом и радикалами аминокислот активного центра;

д) объясните, на чем основана специфичность взаимодействия белка с лигандом.

3. На рисунке представлен активный центр белка и несколько лигандов.

Определите, какой из лигандов с наибольшей вероятностью будет взаимодействовать с активным центром белка и почему.

Какие типы связей возникают в процессе образования комплекса белок-лиганд»?

4. Структурные аналоги естественных лигандов белков могут использоваться в качестве лекарственных препаратов для изменения активности белков.

Ацетилхолин - медиатор передачи возбуждения в нервно-мышечных синапсах. При взаимодействии ацетилхолина с белками - рецепторами постсинаптической мембраны скелетных мышц происходит открытие ионных каналов и мышечное сокращение. Дитилин - лекарство, применяемое при некоторых операциях для расслабления мышц, так как он нарушает передачу нервного импульса через нервно-мышечные синапсы. Объясните механизм действия дитилина как миорелаксирующего препарата. Для этого:

а) напишите формулы ацетилхолина и дитилина и сравните их структуры;

б) опишите механизм расслабляющего действия дитилина.

5. При некоторых заболеваниях у больного повышается температура тела, что рассматривают как защитную реакцию организма. Однако высокие температуры губительны для белков организма. Объясните, почему при температуре выше 40 °С нарушается функция белков и возникает угроза для жизни человека. Для этого вспомните:

1) Строение белков и связи, удерживающие его структуру в нативной конформации;

2) Как меняется структура и функция белков при повышении температуры?;

3) Что такое гомеостаз и почему он важен для поддержания здоровья человека.

Модульная единица 2 ОЛИГОМЕРНЫЕ БЕЛКИ КАК МИШЕНИ РЕГУЛЯТОРНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ МНОГООБРАЗИЕ БЕЛКОВ. МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ

Цели изучения Уметь:

1. Использовать знания об особенностях структуры и функций олигомерных белков для понимания адаптивных механизмов регуляции их функций.

2. Объяснять роль шаперонов в синтезе и поддержании конформации белков в условиях клетки.

3. Объяснять многообразие проявления жизни многообразием структур и функций синтезирующихся в организме белков.

4. Анализировать связь структуры белков с их функцией на примерах сравнения родственных гемопротеинов - миоглобина и гемоглобина, а также представителей пяти классов белков семейства иммуноглобулинов.

5. Применять знания об особенностях физико-химических свойств белков для выбора методов их очистки от других белков и примесей.

6. Интерпретировать результаты количественного и качественного состава белков плазмы крови для подтверждения или уточнения клинического диагноза.

Знать:

1. Особенности строения олигомерных белков и адаптивные механизмы регуляции их функций на примере гемоглобина.

2. Строение и функции шаперонов и их значение для поддержания нативной конформации белков в условиях клетки.

3. Принципы объединения белков в семейства по схожести их конформации и функций на примере иммуноглобулинов.

4. Методы разделения белков, основанные на особенностях их физикохимических свойств.

5. Электрофорез плазмы крови как метод оценки качественного и количественного состава белков.

ТЕМА 1.4. ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ОЛИГОМЕРНЫХ БЕЛКОВ НА ПРИМЕРЕ ГЕМОГЛОБИНА

1. Многие белки имеют в своем составе несколько полипептидных цепей. Такие белки называют олигомерными, а отдельные цепи - протомерами. Протомеры в олигомерных белках соединены множеством слабых нековалентных связей (гидрофобных, ионных, водородных). Взаимодействие

протомеров осуществляется благодаря комплементарности их контактирующих поверхностей.

Количество протомеров в олигомерных белках может сильно варьировать: гемоглобин содержит 4 протомера, фермент аспартатаминотрансфераза - 12 протомеров, а в белок вируса табачной мозаики входит 2120 протомеров, соединенных нековалентными связями. Следовательно, олигомерные белки могут иметь очень большую молекулярную массу.

Взаимодействие одного протомера с другими можно рассматривать как частный случай взаимодействия белка с лигандом, так как каждый протомер служит лигандом для других протомеров. Количество и способ соединения протомеров в белке называется четвертичной структурой белка.

В состав белков могут входить одинаковые или разные по строению протомеры, например, гомодимеры - белки, содержащие два одинаковых протомера, а гетеродимеры - белки, содержащие два разных протомера.

Если в состав белков входят разные протомеры, то на них могут формироваться отличающиеся по структуре центры связывания с разными лигандами. При связывании лиганда с активным центром проявляется функция данного белка. Центр, расположенный на другом протомере, называется аллостерическим (другим, отличным от активного). Связываясь с аллостерическим лигандом или эффектором, он выполняет регуляторную функцию (рис. 1.18). Взаимодействие аллостерического центра с эффектором вызывает конформационные изменения в структуре всего олигомерного белка благодаря его конформационной лабильности. Это влияет на сродство активного центра к специфическому лиганду и регулирует функцию данного белка. Изменение конформации и функции всех протомеров при взаимодействии олигомерного белка хотя бы с одним лигандом носит название кооперативных изменений конформации. Эффекторы, усиливающие функцию белка, называются активаторами, а эффекторы, угнетающие его функцию, - ингибиторами.

Таким образом, у олигомерных белков, а также белков, имеющих доменное строение, появляется новое по сравнению с мономерными белками свойство - способность к аллостерической регуляции функций (регуляции присоединением к белку разных лигандов). Это можно проследить, сравнивая структуры и функции двух близко родственных сложных белков миоглобина и гемоглобина.

Рис. 1.18. Схема строения димерного белка

2. Формирование пространственных структур и функционирование миоглобина.

Миоглобин (Мв) - белок, находящийся в красных мышцах, основная функция которого - создание запасов О 2 , необходимых при интенсивной мышечной работе. Мв - сложный белок, содержащий белковую часть - апоМв и небелковую часть - гем. Первичная структура апоМв определяет его компактную глобулярную конформацию и структуру активного центра, к которому присоединяется небелковая часть миоглобина - гем. Кислород, поступающий из крови в мышцы, связывается с Fe+ 2 гема в составе миоглобина. Мв - мономерный белок, имеющий очень высокое сродство к О 2 , поэтому отдача кислорода миоглобином происходит только при интенсивной мышечной работе, когда парциальное давление O 2 резко снижается.

Формирование конформации Мв. В красных мышцах на рибосомах в ходе трансляции идет синтез первичной структуры Мв, представленной специфической последовательностью 153 аминокислотных остатков. Вторичная структура Мв содержит восемь α-спиралей, называемых латинскими буквами от А до Н, между которыми имеются неспирализованные участки. Третичная структура Мв имеет вид компактной глобулы, в углублении которой между F и Е α-спиралями расположен активный центр (рис. 1.19).

Рис. 1.19. Структура миоглобина

3. Особенности строения и функционирования активного центра Мв. Активный центр Мв сформирован преимущественно гидрофобными радикалами аминокислот, далеко отстоящими друг от друга в первичной структуре (например, Три 3 9 и Фен 138) К активному центру присоединяется плохо растворимые в воде лиганды - гем и О 2 . Гем - специфический лиганд апоМв (рис. 1.20), основу которого составляют четыре пиррольных кольца, соединенных метенильными мостиками; в центре расположен атом Fe+ 2 , соединенный с атомами азота пиррольных колец четырьмя координационными связями. В активном центре Мв кроме гидрофобных радикалов аминокислот имеются также остатки двух аминокислот с гидрофильными радикалами - Гис Е 7 (Гис 64) и Гис F 8 (Гис 93) (рис. 1.21).

Рис. 1.20. Строение гема - небелковой части миоглобина и гемоглобина

Рис. 1.21. Расположение гема и O 2 в активном центре апомиоглобина и протомеров гемоглобина

Гем через атом железа ковалентно связан с Гис F 8 . O 2 присоединяется к железу с другой стороны плоскости гема. Гис Е 7 необходим для правильной ориентации О 2 и облегчает присоединение кислорода к Fe+ 2 гема

Гис F 8 образует координационную связь с Fe+ 2 и прочно фиксирует гем в активном центре. Гис Е 7 необходим для правильной ориентации в активном центре другого лиганда - O 2 при его взаимодействии с Fe+ 2 гема. Микроокружение гема создает условия для прочного, но обратимого связывания O 2 с Fe +2 и препятствует попаданию в гидрофобный активный центр воды, что может привести к его окислению в Fе+ 3 .

Мономерное строение Мв и его активного центра определяет высокое сродство белка к О 2 .

4. Олигомерное строение Нв и регуляция сродства Нв к О 2 лигандами. Гемоглобины человека - семейство белков, так же как и миоглобин относящиеся к сложным белкам (гемопротеинам). Они имеют тетрамерное строение и содержат две α-цепи, но различаются по строению двух других полипептидных цепей (2α-, 2х-цепи). Строение второй полипептидной цепи определяет особенности функционирования этих форм Нв. Около 98% гемоглобина эритроцитов взрослого человека составляет гемоглобин А (2α-, 2р-цепи).

В период внутриутробного развития функционируют два основных типа гемоглобинов: эмбриональный Нв (2α, 2ε), который обнаруживается на ранних этапах развития плода, и гемоглобин F (фетальный) - (2α, 2γ), который приходит на смену раннему гемоглобину плода на шестом месяце внутриутробного развития и только после рождения замещается на Нв А.

Нв А - белок, родственный миоглобину (Мв), содержится в эритроцитах взрослого человека. Строение его отдельных протомеров аналогично таковому у миоглобина. Вторичная и третичная структуры миоглобина и протомеров гемоглобина очень сходны, несмотря на то что в первичной структуре их полипептидных цепей идентичны только 24 аминокислотных остатка (вторичная структура протомеров гемоглобина, так же как миоглобин, содержит восемь α-спиралей, обозначаемых латинскими буквами от А до Н, а третичная структура имеет вид компактной глобулы). Но в отличие от миоглобина гемоглобин имеет олигомерное строение, состоит из четырех полипептидных цепей, соединенных нековалентными связями (рис 1.22).

Каждый протомер Нв связан с небелковой частью - гемом и соседними протомерами. Соединение белковой части Нв с гемом аналогично таковому у миоглобина: в активном центре белка гидрофобные части гема окружены гидрофобными радикалами аминокислот за исключением Гис F 8 и Гис Е 7 , которые расположены по обе стороны от плоскости гема и играют аналогичную роль в функционировании белка и связывании его с кислородом (см. строение миоглобина).

Рис. 1.22. Олигомерная структура гемоглобина

Кроме того, Гис Е 7 выполняет важную дополнительную роль в функционировании Нв. Свободный гем имеет в 25 000 раз более высокое сродство к СО, чем к О 2 . СО в небольших количествах образуется в организме и, учитывая его высокое сродство к гему, он мог бы нарушать транспорт необходимого для жизни клеток О 2 . Однако в составе гемоглобина сродство гема к оксиду углерода превышает сродство к О 2 всего в 200 раз благодаря наличию в активном центре Гис Е 7 . Остаток этой аминокислоты создает оптимальные условия для связывания гема с O 2 и ослабляет взаимодействие гема с СО.

5. Основная функция Нв - транспорт О 2 из легких в ткани. В отличие от мономерного миоглобина, имеющего очень высокое сродство к О 2 и выполняющего функцию запасания кислорода в красных мышцах, олигомерная структура гемоглобина обеспечивает:

1) быстрое насыщение Нв кислородом в легких;

2) способность Нв отдавать кислород в тканях при относительно высоком парциальном давлении O 2 (20-40 мм рт. ст.);

3) возможность регуляции сродства Нв к О 2 .

6. Кооперативные изменения конформации протомеров гемоглобина ускоряют связывание O 2 в легких и отдачу его в ткани. В легких высокое парциальное давление O 2 способствует связыванию его с Нв в активном центре четырех протомеров (2α и 2β). Активный центр каждого протомера, так же как и в миоглобине, расположен между двумя α-спиралями (F и Е) в гидрофобном кармане. Он содержит небелковую часть - гем, прикрепленный к белковой части множеством слабых гидрофобных взаимодействий и одной прочной связью между Fe 2 + гема и Гис F 8 (см. рис. 1.21).

В дезоксигемоглобине, благодаря этой связи с Гис F 8 , атом Fe 2 + выступает из плоскости гема по направлению к гистидину. Связывание O 2 с Fe 2 + происходит по другую сторону гема в области Гис Е 7 с помощью единственной свободной координационной связи. Гис Е 7 обеспечивает оптимальные условия для связывания O 2 с железом гема.

Присоединение O 2 к атому Fe +2 одного протомера вызывает его перемещение в плоскость гема, а за ним и остатка гистидина, связанного с ним

Рис. 1.23. Изменение конформации протомера гемоглобина при соединении с O 2

Это приводит к изменению конформации всех полипептидных цепей за счет их конформационной лабильности. Изменение конформации других цепей облегчает их взаимодействие со следующими молекулами О 2 .

Четвертая молекула О 2 присоединяется к гемоглобину в 300 раз легче, чем первая (рис. 1.24).

Рис. 1.24. Кооперативные изменения конформации протомеров гемоглобина при его взаимодействии с О 2

В тканях каждая следующая молекула O 2 отщепляется легче, чем предыдущая, также за счет кооперативных изменений конформации протомеров.

7. CO 2 и Н+, образующиеся при катаболизме органических веществ, уменьшают сродство гемоглобина к О 2 пропорционально их концентрации. Энергия, необходимая для работы клеток, вырабатывается преимущественно в митохондриях при окислении органических веществ с использованием O 2 , доставляемого из легких гемоглобином. В результате окисления органических веществ образуются конечные продукты их распада: СО 2 и K 2 O, количество которых пропорционально интенсивности протекающих процессов окисления.

СO 2 диффузией попадает из клеток в кровь и проникает в эритроциты, где под действием фермента карбангидразы превращается в угольную кислоту. Эта слабая кислота диссоциирует на протон и бикарбонат ион.

Н+ способны присоединятся к радикалам Гис 14 6 в α- и β-цепях гемоглобина, т.е. в участках, удаленных от гема. Протонирование гемоглобина снижает его сродство к О 2 , способствует отщеплению О 2 от оксиНв, образованию дезоксиНв и увеличивает поступление кислорода в ткани пропорционально количеству образовавшихся протонов (рис. 1.25).

Увеличение количества освобожденного кислорода в зависимости от увеличения концентрации Н+ в эритроцитах называется эффектом Бора (по имени датского физиолога Христиана Бора, впервые открывшего этот эффект).

В легких высокое парциальное давление кислорода способствует его связыванию с дезоксиНв, что уменьшает сродство белка к Н + . Освободившиеся протоны под действием карбангидразы взаимодействуют с бикарбонатами с образованием СО 2 и Н 2 О

Рис. 1.25. Зависимость сродства Нв к О 2 от концентрации СО 2 и протонов (эффект Бора):

А - влияние концентрации СО 2 и Н+ на высвобождение О 2 из комплекса с Нв (эффект Бора); Б - оксигенирование дезоксигемоглобина в легких, образование и выделение СО 2 .

Образовавшийся СО 2 поступает в альвеолярное пространство и удаляется с выдыхаемым воздухом. Таким образом, количество высвобождаемого гемоглобином кислорода в тканях регулируется продуктами катаболизма органических веществ: чем интенсивнее распад веществ, например при физических нагрузках, тем выше концентрация СО 2 и Н + и тем больше кислорода получают ткани в результате уменьшения сродства Нв к О 2 .

8. Аллостерическая регуляция сродства Нв к О 2 лигандом - 2,3-бис- фосфоглицератом. В эритроцитах из продукта окисления глюкозы - 1,3-бисфосфоглицерата синтезируется аллостерический лиганд гемоглобина - 2,3-бисфосфоглицерат (2,3-БФГ). В нормальных условиях концентрация 2,3-БФГ высокая и сравнима с концентрацией Нв. 2,3-БФГ имеет сильный отрицательный заряд -5.

Бисфосфоглицерат в капиллярах тканей, связываясь с дезоксигемоглобином, увеличивает выход кислорода в ткани, уменьшая сродство Нв к О 2 .

В центре тетрамерной молекулы гемоглобина находится полость. Ее образуют аминокислотные остатки всех четырех протомеров (см. рис. 1.22). В капиллярах тканей протонирование Нв (эффект Бора) приводит к разрыву связи между железом гема и О 2 . В молекуле

дезоксигемоглобина по сравнению с оксигемоглобином возникают дополнительные ионные связи, соединяющие протомеры, вследствие чего размеры центральной полости по сравнению с оксигемоглобином увеличиваются. Центральная полость является местом присоединения 2,3-БФГ к гемоглобину. Из-за различия в размерах центральной полости 2,3-БФГ может присоединяться только к дезоксигемоглобину.

2,3-БФГ взаимодействует с гемоглобином в участке, удаленном от активных центров белка и относится к аллостерическим (регуляторным) лигандам, а центральная полость Нв является аллостерическим центром. 2,3-БФГ имеет сильный отрицательный заряд и взаимодействует с пятью положительно заряженными группами двух β-цепей Нв: N-концевой α-аминогруппой Вал и радикалами Лиз 82 Гис 143 (рис. 1.26).

Рис. 1.26. БФГ в центральной полости дезоксигемоглобина

БФГ связывается с тремя положительно заряженными группами в каждой β-цепи.

В капиллярах тканей образующийся дезоксигемоглобин взаимодействует с 2,3-БФГ и между положительно заряженными радикалами β-цепей и отрицательно заряженным лигандом образуются ионные связи, которые изменяют конформацию белка и снижают сродство Нв к О 2 . Уменьшение сродства Нв к О 2 способствует более эффективному выходу О 2 в ткани.

В легких при высоком парциальном давлении кислород взаимодействует с Нв, присоединяясь к железу гема; при этом изменяется конформация белка, уменьшается центральная полость и происходит вытеснение 2,3-БФГ из аллостерического центра

Таким образом, олигомерные белки обладают новыми по сравнению с мономерными белками свойствами. Присоединение лигандов на участках,

пространственно удаленных друг от друга (аллостерических), способно вызывать конформационные изменения во всей белковой молекуле. Благодаря взаимодействию с регуляторными лигандами происходит изменение конформации и адаптация функции белковой молекулы к изменениям окружающей среды.

ТЕМА 1.5. ПОДДЕРЖАНИЕ НАТИВНОЙ КОНФОРМАЦИИ БЕЛКОВ В УСЛОВИЯХ КЛЕТКИ

В клетках в процессе синтеза полипептидных цепей, их транспорта через мембраны в соответствующие отделы клетки, в процессе фолдинга (формирования нативной конформации) и при сборке олигомерных белков, а также в период их функционирования в структуре белков возникают промежуточные, склонные к агрегации, нестабильные конформации. Гидрофобные радикалы, в нативной конформации обычно спрятанные внутри белковой молекулы, в нестабильной конформации оказываются на поверхности и стремятся к объединению с такими же плохо растворимыми в воде группами других белков. В клетках всех известных организмов обнаружены специальные белки, которые обеспечивают оптимальный фолдинг белков клетки, стабилизируют их нативную конформацию при функционировании и, что особенно важно, поддерживают структуру и функции внутриклеточных белков при нарушении гомеостаза. Эти белки получили название «шапероны», что в переводе с французского обозначает «няня».

1. Молекулярные шапероны и их роль в предотвращении денатурации белков.

Шапероны (Ш) классифицируются по массе субъединиц. Высокомолекулярные шапероны имеют массу от 60 до 110 кД. Среди них наиболее изучены три класса: Ш-60, Ш-70 и Ш-90. Каждый класс включает семейство родственных белков. Так, в состав Ш-70 входят белки с молекулярной массой от 66 до 78 кД. Низкомолекулярные шапероны имеют молекулярную массу от 40 до 15 кД.

Среди шаперонов различают конститутивные белки, высокий базальный синтез которых не зависит от стрессовых воздействий на клетки организма, и индуцибельные, синтез которых в нормальных условиях идет слабо, но резко возрастает при стрессовых воздействиях. Индуцибельные шапероны называют также «белками теплового шока», так как впервые они были обнаружены в клетках, подвергавшихся воздействию высоких температур. В клетках из-за высокой концентрации белков самопроизвольная ренативация частично денатурированных белков затруднена. Ш-70 могут предотвращать начавшийся процесс денатурации и способствовать восстановлению нативной конформации белков. Молекулярные шапероны-70 - высококонсервативный класс белков, находящихся во всех отделах клетки: цитоплазме, ядре, эндоплазматическом ретикулуме, митохондриях. На карбоксильном конце единственной полипептидной цепи Ш-70 имеется участок, который представляет собой бороздку, способный взаимодействовать с пептидами длиной

от 7 до 9 аминокислотных остатков, обогащенных гидрофобными радикалами. Такие участки в глобулярных белках встречаются примерно через каждые 16 аминокислот. Ш-70 способны защищать белки от температурной инактивации и восстанавливать конформацию и активность частично денатурированных белков.

2. Роль шаперонов в фолдинге белков. При синтезе белков на рибосоме N-концевая область полипептида синтезируется раньше С-концевой. Для формирования нативной конформации необходима полная аминокислотная последовательность белка. В процессе синтеза белков шапероны-70, благодаря строению их активного центра, способны закрывать склонные к агрегации участки полипептида, обогащенные гидрофобными радикалами аминокислот до завершения синтеза (рис 1.27, А).

Рис. 1.27. Участие шаперонов в фолдинге белков

А - участие шаперонов-70 в предотвращении гидрофобных взаимодействий между участками синтезирующегося полипептида; Б - формирование нативной конформации белка в шапероновом комплексе

Многие высокомолекулярные белки, имеющие сложную конформацию, например доменное строение, осуществляют фолдинг в специальном пространстве, сформированном Ш-60. Ш-60 функционируют в виде олигомерного комплекса, состоящего из 14 субъединиц. Они формируют два полых кольца, каждое из которых состоит из семи субъединиц, эти кольца соединены друг с другом. Каждая субъединица Ш-60 состоит из трех доменов: апикального (верхушечного), обогащенного гидрофобными радикалами, обращенными в полость кольца, промежуточного и экваториального (рис. 1.28).

Рис. 1.28 . Структура шаперонинового комплекса, состоящего из 14 Ш-60

А - вид сбоку; Б - вид сверху

Синтезированные белки, имеющие на поверхности элементы, характерные для несвернутых молекул, в частности гидрофобные радикалы, попадают в полость шапероновых колец. В специфической среде этих полостей происходит перебор возможных конформаций, пока не будет найдена единственная, энергетически наиболее выгодная (рис. 1.27, Б). Формирование конформаций и высвобождение белка сопровождается гидролизом АТФ в экваториальной области. Обычно такой шаперонозависимый фолдинг требует затрат значительного количества энергии.

Кроме участия в формировании трехмерной структуры белков и ренативации частично денатурированных белков, шапероны также необходимы для протекания таких фундаментальных процессов, как сборка олигомерных белков, узнавание и транспорт в лизосомы денатурированных белков, транспорт белков через мембраны, участие в регуляции активности белковых комплексов.

ТЕМА 1.6. МНОГООБРАЗИЕ БЕЛКОВ. СЕМЕЙСТВА БЕЛКОВ НА ПРИМЕРЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

1. Белки играют решающую роль в жизнедеятельности отдельных клеток и всего многоклеточного организма, а их функции удивительно многообразны. Это определяется особенностями первичной структуры и конформаций белков, уникальностью строения активного центра и способностью связывать специфические лиганды.

Лишь очень небольшая часть всех возможных вариантов пептидных цепей может принять стабильную пространственную структуру; большинство

из них может принимать множество конформаций с примерно одинаковой энергией Гиббса, но с различными свойствами. Первичная структура большинства известных белков, отобранных биологической эволюцией, обеспечивает исключительную стабильность одной из конформаций, которая определяет особенности функционирования этого белка.

2. Семейства белков. В пределах одного биологического вида замены аминокислотных остатков могут приводить к возникновению разных белков, выполняющих родственные функции и имеющих гомологичные последовательности аминокислот. Такие родственные белки имеют поразительно сходные конформации: количество и взаиморасположение α-спиралей и (или) β-структур, большинство поворотов и изгибов полипептидных цепей похожи или идентичны. Белки с гомологичными участками полипептидной цепи, сходной конформацией и родственными функциями выделяют в семейства белков. Примеры семейств белков: сериновые протеиназы, семейство иммуноглобулинов, семейство миоглобина.

Сериновые протеиназы - семейство белков, выполняющих функцию протеолитических ферментов. К ним относятся пищеварительные ферменты - химотрипсин, трипсин, эластаза и многие факторы свертывания крови. Эти белки имеют в 40% положений идентичные аминокислоты и очень близкую конформацию (рис. 1.29).

Рис. 1.29 . Пространственные структуры эластазы (А) и химотрипсина (Б)

Некоторые аминокислотные замены привели к изменению субстратной специфичности этих белков и возникновению функционального многообразия внутри семейства.

3. Семейство иммуноглобулинов. В работе иммунной системы огромную роль играют белки суперсемейства иммуноглобулинов, которое включает в себя три семейства белков:

Антитела (иммуноглобулины);

Рецепторы Т-лимфоцитов;

Белки главного комплекса гистосовместимости - МНС 1-го и 2-го классов (Major Histocompatibility Complex).

Все эти белки имеют доменное строение, состоят из гомологичных иммуноподобных доменов и выполняют сходные функции: взаимодействуют с чужеродными структурами, либо растворенными в крови, лимфе или межклеточной жидкости (антитела), либо находящимися на поверхности клеток (собственных или чужеродных).

4. Антитела - специфические белки, вырабатываемые В-лимфоцитами в ответ на попадание в организм чужеродной структуры, называемой антигеном.

Особенности строения антител

Простейшие молекулы антител состоят из четырех полипептидных цепей: двух идентичных легких - L, содержащих около 220 аминокислот, и двух идентичных тяжелых - Н, состоящих из 440-700 аминокислот. Все четыре цепи в молекуле антитела соединены множеством нековалентных связей и четырьмя дисульфидными связями (рис. 1.30).

Легкие цепи антитела состоят из двух доменов: вариабельного (VL), находящегося в N-концевой области полипептидной цепи, и константного (CL), расположенного на С-конце. Тяжелые цепи обычно имеют четыре домена: один вариабельный (VH), находящийся на N-конце, и три константных (CH1, CH2, СНЗ) (см. рис. 1.30). Каждый домен иммуноглобулина имеет β-складчатую суперструктуру, в которой два остатка цистеина соединены дисульфидной связью.

Между двумя константными доменами СН1 и СН2 имеется участок, содержащий большое число остатков пролина, которые препятствуют формированию вторичной структуры и взаимодействию соседних Н-цепей на этом отрезке. Эта шарнирная область придает молекуле антитела гибкость. Между вариабельными доменами тяжелых и легких цепей находятся два идентичных антигенсвязывающих участка (активные центры для связывания антигенов), поэтому такие антитела часто называют бивалентами. В связывании антигена с антителом участвует не вся аминокислотная последовательность вариабельных участков обеих цепей, а всего лишь 20-30 аминокислот, расположенных в гипервариабельных областях каждой цепи. Именно эти области определяют уникальную способность каждого вида антитела взаимодействовать с соответствующим комплементарным антигеном.

Антитела - одна из линий защиты организма против внедрившихся чужеродных организмов. Их функционирование можно разделить на два этапа: первый этап - узнавание и связывание антигена на поверхности чужеродных организмов, что возможно благодаря наличию в структуре антитела антигенсвязывающих участков; второй этап - инициация процесса инактивации и разрушения антигена. Специфичность второго этапа зависит от класса антител. Существует пять классов тяжелых цепей, отличающихся друг от друга по строению константных доменов: α, δ, ε, γ и μ, в соответствии с которыми различают пять классов иммуноглобулинов: A, D, Е, G и М.

Особенности строения тяжелых цепей придают шарнирным участкам и С-концевым областям тяжелых цепей характерную для каждого класса конформацию. После связывания антигена с антителом конформационные изменения константных доменов определяют путь удаления антигена.

Рис. 1. 30. Доменное строение IgG

Иммуноглобулины М

Иммуноглобулины М имеют две формы.

Мономерная форма - 1-й класс антител, продуцируемый развивающимся В-лимфоцитом. Впоследствии многие В-клетки переключаются на выработку других классов антител, но с тем же антигенсвязывающим участком. IgM встраивается в мембрану и выполняет роль антигенраспознающего рецептора. Встраивание IgM в мембрану клеток возможно благодаря наличию в хвостовой части участка 25 гидрофобных аминокислотных остатков.

Секреторная форма IgM содержит пять мономерных субъединиц, связанных друг с другом дисульфидными связями и дополнительной полипептидной J-цепью (рис. 1.31). Тяжелые цепи мономеров этой формы не содержат гидрофобной хвостовой части. Пентамер имеет 10 центров связывания с антигеном и поэтому эффективен в распознавании и удалении впервые попавшего в организм антигена. Секреторная форма IgM - основной класс антител, секретируемых в кровь при первичном иммунном ответе. Связывание IgM с антигеном изменяет конформацию IgM и индуцирует связывание его с первым белковым компонентом системы комплемента (система комплемента - набор белков, участвующих в уничтожении антигена) и активацию этой системы. Если антиген расположен на поверхности микроорганизма, система комплемента вызывает нарушение целостности клеточной мембраны и гибель бактериальной клетки.

Иммуноглобулины G

В количественном отношении этот класс иммуноглобулинов преобладает в крови (75% от всех Ig). IgG - мономеры, основной класс антител, секретируемый в кровь при вторичном иммунном ответе. После взаимодействия IgG с поверхностными антигенами микроорганизмов комплекс антиген-антитело способен связывать и активировать белки системы комплемента или может взаимодействовать со специфическими рецепторами макрофагов и нейтрофилов. Взаимодействие с фагоцитами приводит

Рис. 1.31. Строение секреторной формы IgM

к поглощению комплексов антиген-антитело и разрушению их в фагосомах клеток. IgG - единственный класс антител, которые способны проникать через плацентарный барьер и обеспечивать внутриутробную защиту плода от инфекций.

Иммуноглобулины А

Основной класс антител, присутствующий в секретах (молоке, слюне, секретах дыхательных путей и кишечного тракта). IgA секретируются в основном в димерной форме, где мономеры связаны друг с другом через дополнительную J-цепь (рис. 1.32).

IgA не взаимодействуют с системой комплемента и фагоцитирующими клетками, но, связываясь с микроорганизмами, антитела препятствуют их присоединению к эпителиальным клеткам и проникновению в организм.

Иммуноглобулины Е

Иммуноглобулины Е представлены мономерами, в которых тяжелые ε-цепи содержат, так же как и μ-цепи иммуноглобулинов М, один вариабельный и четыре константных домена. IgE после секреции связываются своими

Рис. 1.32. Строение IgA

С-концевыми участками с соответствующими рецепторами на поверхности тучных клеток и базофилов. В результате они становятся рецепторами для антигенов на поверхности данных клеток (рис. 1.33).

Рис. 1.33. Взаимодействие IgE с антигеном на поверхности тучной клетки

После того как происходит присоединение антигена к соответствующим антигенсвязывающим участкам IgE, клетки получают сигнал к секреции биологически активных веществ (гистамина, серотонина), которые в большой мере ответственны за развитие воспалительной реакции и за проявление таких аллергических реакций, как астма, крапивница, сенная лихорадка.

Иммуноглобулины D

Иммуноглобулины D обнаружены в сыворотке в очень небольшом количестве, они являются мономерами. В тяжелых δ-цепях имеются один вариабельный и три константных домена. IgD выполняют роль рецепторов В-лимфоцитов, другие функции пока неизвестны. Взаимодействие специфических антигенов с рецепторами на поверхности В-лимфоцитов (IgD) приводит к передаче этих сигналов в клетку и включению механизмов, обеспечивающих размножение данного клона лимфоцитов.

ТЕМА 1.7. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ И МЕТОДЫ ИХ РАЗДЕЛЕНИЯ

1. Индивидуальные белки различаются по физико-химическим свойствам:

Форме молекул;

Молекулярной массе;

Суммарному заряду, величина которого зависит от соотношения анионных и катионных групп аминокислот;

Соотношению полярных и неполярных радикалов аминокислот на поверхности молекул;

Степени устойчивости к воздействию различных денатурирующих агентов.

2. Растворимость белков зависит от свойств белков, перечисленных выше, а также от состава среды, в которой растворяется белок (значения рН, солевого состава, температуры, наличия других органических веществ, способных взаимодействовать с белком). Величина заряда белковых молекул - один из факторов, влияющих на их растворимость. При потере заряда в изоэлектрической точке белки легче агрегируют и выпадают в осадок. Это особенно характерно для денатурированных белков, у которых на поверхности оказываются гидрофобные радикалы аминокислот.

На поверхности белковой молекулы имеются как положительно, так и отрицательно заряженные радикалы аминокислот. Количество этих групп, а следовательно, и суммарный заряд белков зависят от рН среды, т.е. соотношения концентрации Н+- и ОН - -групп. В кислой среде повышение концентрации Н+ приводит к подавлению диссоциации карбоксильных групп -СОО - + Н+ > - СООН и понижению отрицательного заряда белков. В щелочной среде связывание избытка ОН - протонами, образующимися при диссоциации аминогрупп -NH 3 + + ОН - - NH 2 + Н 2 О с образованием воды, приводит к уменьшению положительного заряда белков. Значение рН, при котором белок имеет суммарный нулевой заряд, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). В ИЭТ число положительно и отрицательно заряженных групп одинаково, т.е. белок находится в изоэлектрическом состоянии.

3. Разделение индивидуальных белков. Особенности строения и функционирования организма зависят от набора белков, синтезирующихся в нем. Изучение строения и свойств белков невозможно без их выделения из клетки и очистки от других белков и органических молекул. Стадии выделения и очистки индивидуальных белков:

Разрушение клеток изучаемой ткани и получение гомогената.

Разделение гомогената на фракции центрифугированием, получение ядерной, митохондриальной, цитозольной или иной фракции, содержащей искомый белок.

Избирательная тепловая денатурация - кратковременное нагревание раствора белков, при котором можно удалить часть денатурированных белковых примесей (в том случае, если белок относительно термостабилен).

Высаливание. Различные белки выпадают в осадок при разных концентрациях соли в растворе. Постепенно повышая концентрацию соли, можно получить ряд отдельных фракций с преимущественным содержанием выделяемого белка в одной из них. Наиболее часто для фракционирования белков используют сульфат аммония. Белки с наименьшей растворимостью выпадают в осадок при небольших концентрациях солей.

Гель-фильтрация - метод просеивания молекул через набухшие гранулы сефадекса (трехмерные полисахаридные цепи декстрана, имеющие поры). Скорость прохождения белков через колонку, заполненную сефадексом, будет зависеть от их молекулярной массы: чем меньше масса молекул белка, тем легче они проникают внутрь гранул и дольше там задерживаются, чем больше масса, тем быстрее они элюируют с колонки.

Ультрацентрифугирование - метод, заключающийся в том, что белки в центрифужной пробирке помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора скорость оседания белков пропорциональна их молекулярной массе: фракции более тяжелых белков расположены ближе ко дну пробирки, более легкие - ближе к поверхности.

Электрофорез - метод, в основе которого лежат различия в скорости движения белков в электрическом поле. Эта величина пропорциональна заряду белков. Электрофорез белков проводят на бумаге (в этом случае скорость движения белков пропорциональна только их заряду) или в полиакриламидном геле с определенной величиной пор (скорость движения белков пропорциональна их заряду и молекулярной массе).

Ионообменная хроматография - метод фракционирования, основанный на связывании ионизированных групп белков с противоположно заряженными группами ионообменных смол (нерастворимых полимерных материалов). Прочность связывания белка со смолой пропорциональна заряду белка. Белки, адсорбированные на ионообменном полимере, можно смыть растворами NaCl с возрастающими концентрациями; чем меньше заряд белка, тем меньшая концентрация NaCl потребуется, чтобы смыть белок, связанный с ионогенными группами смолы.

Аффинная хроматография - наиболее специфический метод выделения индивидуальных белков.К инертному полимеру ковалентно присоединяется лиганд какого-либо белка. При пропускании раствора белков через колонку с полимером за счет комплементарного связывания белка с лигандом на колонке адсорбируется только специфичный для данного лиганда белок.

Диализ - метод, применяемый для удаления низкомолекулярных соединений из раствора выделяемого белка. Метод основан на неспособности белков проходить через полупроницаемую мембрану в отличие от низкомолекулярных веществ. Применяется для очистки белков от низкомолекулярных примесей, например от солей после высаливания.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ ВНЕАУДИТОРНОЙ РАБОТЫ

1. Заполните табл. 1.4.

Таблица 1.4. Сравнительный анализ структуры и функций родственных белков - миоглобина и гемоглобина

а) вспомните строение активного центра Мв и НЬ. Какую роль играют гидрофобные радикалы аминокислот в формировании активных центров этих белков? Опишите строение активного центра Мв и НЬ и механизмы присоединения к нему лигандов. Какую роль играют остатки Гис F 8 и Гис Е 7 в функционировании активного центра Мв иНв?

б) какими новыми свойствами по сравнению с мономерным миоглобином обладает близко родственный олигомерный белок - гемоглобин? Объясните роль кооперативных изменений конформации протомеров в молекуле гемоглобина, влияние концентраций СО 2 и протонов на сродство гемоглобина к кислороду, а также роль 2,3-БФГ в аллостерической регуляции функции НЬ.

2. Дайте характеристику молекулярным шаперонам, обращая внимание на связь их структуры с функцией.

3. Какие белки объединяют в семейства? На примере семейства иммуноглобулинов определите сходные черты строения и родственные функции белков этого семейства.

4. Часто для биохимических и медицинских целей требуются очищенные индивидуальные белки. Объясните, на каких физико-химических свойствах белков основаны используемые методы их разделения и очистки.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Выберите правильные ответы.

Функции гемоглобина:

A. Транспорт О 2 из легких в ткани Б. Транспорт Н + из тканей в легкие

B. Поддержание постоянства рН крови Г. Транспорт СО 2 из легких в ткани

Д. Транспорт СО 2 из тканей в легкие

2. Выберите правильные ответы. Лигандом α-протомера Нв является: A. Гем

Б. Кислород

B. СО Г. 2,3-БФГ

Д. β-Протомер

3. Выберите правильные ответы.

Гемоглобин в отличие от миоглобина:

A. Имеет четвертичную структуру

Б. Вторичная структура представлена только α-спиралями

B. Относится к сложным белкам

Г. Взаимодействует с аллостерическим лигандом Д. Ковалентно связан с гемом

4. Выберите правильные ответы.

Сродство Нв к О 2 уменьшается:

A. При присоединении одной молекулы О 2 Б. При отщеплении одной молекулы О 2

B. При взаимодействии с 2,3-БФГ

Г. При присоединении к протомерам Н + Д. При снижении концентрации 2,3-БФГ

5. Установите соответствие.

Для типов Нв характерно:

A. В дезокси форме образует фибриллярные агрегаты Б. Содержит в составе две α- и две δ-цепи

B. Преобладающая форма Нв в эритроцитах взрослого человека Г. В активном центре содержит гем с Fе+ 3

Д. Содержит в составе две α- и две γ-цепи 1. НвА 2.

6. Установите соответствие.

Лиганды Нв:

A. Связывается с Нв в аллостерическом центре

Б. Имеет очень высокое сродство к активному центру Нв

B. Присоединяясь, повышает сродство Нв к O 2 Г. Окисляет Fe+ 2 в Fе+ 3

Д. Образует ковалентную связь с гисF8

7. Выберите правильные ответы.

Шапероны:

A. Белки, присутствующие во всех отделах клетки

Б. Синтез усиливается при стрессовых воздействиях

B. Участвуют в гидролизе денатурированных белков

Г. Участвуют в поддержании нативной конформации белков

Д. Создают органеллы, в которых формируется конформация белков

8. Установите соответствие. Иммуноглобулины:

A. Секреторная форма имеет пентамерную форму

Б. Класс Ig, проникающих через плацентарный барьер

B. Ig - рецептор тучных клеток

Г. Основной класс Ig, присутствующих в секретах эпителиальных клеток. Д. Рецептор В-лимфоцитов, активация которого обеспечивает размножение клеток

9. Выберите правильные ответы.

Иммуноглобулины Е:

A. Вырабатываются макрофагами Б. Имеют тяжелые ε-цепи.

B. Встраиваются в мембрану Т-лимфоцитов

Г. Выполняют роль мембранных рецепторов антигенов на тучных клетках и базофилах

Д. Ответственны за проявление аллергических реакций

10. Выберите правильные ответы.

Метод разделения белков основан на различиях в их молекулярной массе:

A. Гель-фильтрация

Б. Ультрацентрифугирование

B. Электрофорез в полиакриламидном геле Г. Ионообменная хроматография

Д. Аффинная хроматография

11. Выберите правильный ответ.

Метод разделения белков основан на различиях в их растворимости в воде:

A. Гель-фильтрация Б. Высаливание

B. Ионообменная хроматография Г. Аффинная хроматография

Д. Электрофорез в полиакриламидном геле

ЭТАЛОНЫ ОТВЕТОВ К «ЗАДАНИЯМ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ»

1. А, Б, В, Д

2. А, Б, В, Д

5. 1-В, 2-А, 3-Г

6. 1-В, 2-Б, 3-А

7. А, Б, Г, Д

8. 1-Г; 2-Б, 3-В

ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ И ПОНЯТИЯ

1. Олигомерные белки, протомер, четвертичная структура белков

2. Кооперативные изменения конформации протомеров

3. Эффект Бора

4. Аллостерическая регуляция функций белков, аллостерический центр и аллостерический эффектор

5. Молекулярные шапероны, белки теплового шока

6. Семейства белков (сериновые протеазы, иммуноглобулины)

7. IgM-, G-, Е-, А-связь структуры с функцией

8. Суммарный заряд белков, изоэлектрическая точка белков

9. Электрофорез

10. Высаливание

11. Гель-фильтрация

12. Ионообменная хроматография

13. Ультрацентрифугирование

14. Аффинная хроматография

15. Электрофорез белков плазмы крови

ЗАДАНИЯ ДЛЯ АУДИТОРНОЙ РАБОТЫ

1. Сравните зависимости степеней насыщения гемоглобина (Нв) и миоглобина (Mb) кислородом от его парциального давления в тканях

Рис. 1.34. Зависимость насыщения Мв и НЬ кислородом от его парциального давления

Обратите внимание, что форма кривых насыщения белков кислородом различна: для миоглобина - гипербола, для гемоглобина - сигмоидная форма.

1. сравните значения парциального давления кислорода, при котором Мв и Нв насыщены О 2 на 50%. Какой из этих белков характеризуется более высоким сродством к О 2 ?

2. какие особенности строения Мв определяют его высокое сродство к О 2 ?

3. какие особенности строения Нв позволяют ему отдавать О 2 в капиллярах покоящихся тканей (при относительно высоком парциальном давлении О 2) и резко увеличивать эту отдачу в работающих мышцах? Какое свойство олигомерных белков обеспечивает этот эффект?

4. вычислите, какое количество О 2 (в %) отдает оксигенированный гемоглобин покоящейся и работающей мышце?

5. сделайте выводы о связи структуры белка с его функцией.

2. Количество освобождаемого гемоглобином кислорода в капиллярах зависит от интенсивности процессов катаболизма в тканях (эффект Бора). Как изменения метаболизма в тканях регулируют сродство НЬ к O 2 ? Влияние СО 2 и Н+ на сродство НЬ к О 2

1. опишите эффект Бора.

2. в каком направлении протекает процесс, представленный на схеме:

а) в капиллярах легких;

б) в капиллярах тканей?

3. в чем физиологическое значение эффекта Бора?

4. почему взаимодействие Нв с Н+ на участках, удаленных от гема, изменяет сродство белка к О 2 ?

3. Сродство НЬв к О 2 зависит от концентрации его лиганда - 2,3-бифосфо- глицерата, который является аллостерическим регулятором сродства Нв к О 2 . Почему взаимодействие лиганда в участке, удаленном от активного центра, влияет на функцию белка? Как 2,3-БФГ регулирует сродство НЬ к О 2 ? Для решения задачи ответьте на следующие вопросы:

1. где и из чего синтезируется 2.3-бифосфоглицерат (2,3-БФГ)? Напишите его формулу, укажите заряд данной молекулы.

2. с какой формой гемоглобина (окси или дезокси) взаимодействует БФГ и почему? В каком участке молекулы Нв происходит взаимодействие?

3. в каком направлении протекает процесс, представленный на схеме

а) в капиллярах тканей;

б) в капиллярах легких?

4. где должна быть более высокой концентрация комплекса

Нв-2,3-БФГ:

а) в капиллярах мышц, находящихся в состоянии покоя,

б) в капиллярах работающих мышц (при условии одинаковой концентрации БФГ в эритроцитах)?

5. как изменится сродство Нв к кислороду при адаптации человека к условиям высокогорья, если концентрация БФГ в эритроцитах при этом повышается? В чем физиологическое значение этого явления?

4. Разрушение 2,3-БФГ при хранении консервированной крови нарушает функции Нв. Как изменится сродство Нв к O 2 в консервированной крови, если концентрация 2,3-БФГ в эритроцитах может уменьшатся с 8 до 0,5 ммол/л. Можно ли переливать такую кровь тяжелобольным пациентам, если концентрация 2,3-БФГ восстанавливается не ранее чем через трое суток? Можно ли добавлением в кровь 2,3-БФГ восстановить функции эритроцитов?

5. Вспомните строение простейших молекул иммуноглобулинов. Какую роль играют иммуноглобулины в работе иммунной системы? Почему Ig часто называют бивалентами? Как структура Ig связана с их функцией? (Опишите на примере какого-либо класса иммуноглобулинов.)

Физико-химические свойства белков и методы их разделения.

6. Как суммарный заряд белка влияет на его растворимость?

а) определите суммарный заряд пептида при рН 7

Ала-Глу-Тре-Про-Асп-Лиз-Цис

б) как изменится заряд этого пептида при рН >7, рН <7, рН <<7?

в) что такое изоэлектрическая точка белка (ИЭТ) и в какой среде лежит

ИЭТ данного пептида?

г) при каком значении рН будет наблюдаться наименьшая растворимость данного пептида.

7. Почему кислое молоко в отличие от свежего при кипячении «сворачивается» (т.е. белок молока казеин выпадает в осадок)? В свежем молоке молекулы казеина имеют отрицательный заряд.

8. Для разделения индивидуальных белков используется метод гельфильтрации. Смесь, содержащую белки А, В, С с молекулярными массами, равными соответственно 160 000, 80 000 и 60 000, анализировали методом гель-фильтрации (рис. 1.35). Гранулы набухшего геля проницаемы для белков с молекулярной массой меньше 70 000. Какой принцип лежит в основе данного метода разделения? Какой из графиков правильно отражает результаты фракционирования? Укажите порядок выхода белков А, В и С с колонки.

Рис. 1.35. Использование метода гель-фильтрации для разделения белков

9. На рис. 1.36, А представлена схема электрофореза на бумаге белков сыворотки крови здорового человека. Относительные количества белковых фракций, полученных с помощью этого метода, составляют: альбумины 54-58%, α 1 -глобулины 6-7%, α 2 -глобулины 8-9%, β-глобулины 13%, γ-глобулины 11-12%.

Рис. 1.36 Электрофорез на бумаге белков плазмы крови здорового человека (А) и больного (Б)

I - γ-глобулины; II - β-глобулины; III - α 2 -глобулин; IV - α 2 -глобулин; V - альбумины

Многие болезни сопровождаются количественными изменениями в составе сывороточных белков (диспротеинемии). Характер этих изменений учитывается при постановке диагноза и оценке тяжести и стадии заболевания.

С помощью данных, приведенных в табл. 1.5, сделайте предположение о заболевании, для которого характерен электрофоретический профиль, представленный на рис. 1.36.

Таблица 1.5. Изменение концентрации белков сыворотки крови при патологии

Пространственная структура зависит не от длины полипептидной цепи, а от последовательности аминокислотных остатков, специфичной для каждого белка, а также от боковых радикалов, свойственных соответствующим амино-кислотам. Пространственную трехмерную структуру или конформацию белко-вых макромолекул образуют в первую очередь водородные связи, а также гидрофобные взаимодействия между неполярными боковыми радикалами аминокислот. Водородные связи играют огромную роль в формировании и поддержании пространственной структуры белковой макромолекулы. Что касается гидрофобных взаимодействий, то они возникают в резуль-тате контакта между неполярными радикалами, неспособными разорвать во-дородные связи между молекулами воды, которая вытесняется на поверхность белковой глобулы. По мере синтеза белка неполярные химические группиров-ки собираются внутри глобулы, а полярные вытесняются на ее поверхность. Таким образом, белковая молекула может быть нейтральной, заряженной по-ложительно или же отрицательно в зависимости от рН растворителя и ионо-генных групп в белке. К слабым взаимодействиям относят также ионные связи и ван-дер-ваальсовы взаимодействия. Кроме того, конформация белков под-держивается ковалентными связями S — S , образующимися между двумя остат-ками цистеина. В результате гидрофобных и гидрофильных взаимодействий молекула белка спонтанно принимает од-ну или несколько наиболее термодинами-чески выгодных конформаций, причем, если в результате каких-либо внешних воздействий нативная конформация нару-шается, возможно полное или почти пол-ное ее восстановление. Таким образом, конформация белков представляет собой трехмерную структуру, причем в результате ее образования мно-гие атомы, находящиеся на удаленных участках полипептидной цепи, сближаются и, воздействуя друг на друга, приоб-ретают новые свойства, отсутствующие у индивидуальных аминокислот или небольших полипептидов. Это так называемая третичная структура, характе-ризующаяся ориентацией полипептидных цепей в пространстве. Третичная структура глобулярных и фибриллярных белков существенно от-личается друг от друга. Принято форму белковой молекулы характеризовать таким показателем, как степень асимметрии (отношение длинной оси моле-кулы к короткой). У глобулярных белков степень асимметрии равна 3—5, что касается фибриллярных белков, то эта величина у них гораздо больше (от 80 до 150). Гипотеза расплавленной глобулы. В рамках этой концепции выделяют не-сколько этапов самосборки белков. 1. В развернутой полипептидной цепи с помощью водородных связей и гидрофобныхвзаимодействийобразуютсяотдельныеучасткивторичной структуры, служащие как бы затравками для формирования полных вторич-ных и супервторичных структур. 2. Когда число этих участков достигает определенной пороговой величины, происходит переориентация боковых радикалов и переход полипептидной цепи в новую более компактную форму, причем число нековалентных связей значительно увеличивается. Характерной особенностью этой стадии является образо-вание специфических контактов между ато-мами, находящимися на удаленных участ-ках полипептидной цепи, но оказавшихся сближенными в результате образования тре-тичной структуры. 3. На последнем этапе формируется нативная конформация белковой молекулы, связанная с замыканием дисульфидных свя-зей и окончательной стабилизацией белко-вой конформации. Вторым ферментом, катализирующим образование и изомеризацию дисульфидных связей, является протеиндисульфидизомераза, в функции которой входит также расщепление неправильно образованных ди-сульфидных мостиков. Кроме того, в клетках имеется ряд каталитически неактивных белков, ко-торые тем не менее вносят большой вклад в образование пространственных структур белков. Это так называемые шапироны и шапиронины Шапироны помогают правильной сборке трехмерной белковой конфор-мации путем образования обратимых нековалентных комплексов с частично свернутой полипептидной цепью, одновременно ингибируя неправильно об-разованные связи, ведущие к формированию функционально неактивных бел-ковых структур. В перечень функций, свойственных шапиронам, входит защи-та расплавленных глобул от агрегации, а также перенос новосинтезированных белков в различные локусы клеток. Шапироны преимущественно являются белками теплового шока, синтез которых резко усиливается при стрессовом температурном воздействии, поэтому их называют еще hsp (heat shock pro - teins ). Семейства этих белков найдены в микробных, растительных и живот-ных клетках. Классификация шапиронов основана на их молекулярной массе, которая варьирует от 10 до 90 kDa . В основном функции шапиронов и шапиронинов различаются, хотя и те, и другие являются белками-помощниками процессов образования трехмерной структуры белков. Шапироны удерживают новосинтезированную полипептидную цепь в развернутом состоянии, не да-вая ей свернуться в отличную от нативной форму, а шапиронины обеспечивают условия для единственно правильной, нативной структуры белка.

POST- коды Award BIOS Medallion V 6.0

POST-код (hex) Выполненная проверка

Выполнение стартовых процедур POST из Flash BIOS

CF Раннее определение типа процессора. Запись результатов в CMOS. Функциональный тест чтения/записи CMOS.

Если определение типа процессора или запись в CMOS закончились неудачей, устанавливается фатальная ошибка операции и выполнение POST останавливается

C0 Предварительная инициализация чипсета.

Запрет областей теневого ОЗУ, отключение кэша L2. Очистка кэша L1.

Программирование следующих базовых регистров чипсета.

• Контроллеров прерываний: прием по фронту IRQ, Master Controller — IRQ 00h=INT 8...IRQ 7=INT 0Fh, Slave Controller — IRQ 8= INT 70h...IRQ 15=INT 77h.

• Контроллеров ПДП.

• Интервального таймера: Counter 0 — режим деления частоты на 65 536 (18,2 Гц) для генерации запросов IRQ 0 системных часов. Counter 1 — выработка импульсов для регенерации DRAM (128 циклов выполняется за 2 мс или интервал между регенерацией двух строк составляет около 15 мкс). Counter 2 — используется для озвучивания системного динамика.

• RTC инициализируется в том случае, если произошел сбой питания от аккумулятора. Если сбоя Vcc (bat) не было, то инициализируются только регистры, отвечающие за взаимодействие RTC и процессора, но не часы

	Проверка типа, объема, старшего адреса и ECC ОЗУ. Проверка первых 256 Кбайт ОЗУ.
	Организация в этой области транзитного буфера, в который из Flash BIOS
	копируется Boot Block для проверки контрольных сумм
	Проверка контрольной суммы BIOS и наличия метки BBSS. Если проверки некорректны,
	принимается решение о частичном повреждении ИМС Flash BIOS. Если проверки
	корректны, то в буфер копируется программа распаковки системной BIOS
	Распаковка системной BIOS в ОЗУ, копирование в ОЗУ факультативной системы
	BIOS. Подготовка к затенению BIOS
	Копирование выполняемого кода POST в область E000h-F000h теневого ОЗУ.
	Передача управления модулю Boot Block.
	Начало выполнения POST из теневого ОЗУ.

Проверка целостности структуры BIOS. Если контрольные суммы проверки служебных полей BIOS совпадают, выполнение проверки ОЗУ продолжается, в противном случае управление передается программам восстановления BIOS

Выполнение POST в теневом ОЗУ (Shadow RAM )

1 По физическому адресу 1000:0000h распаковывается модуль BIOS — программа XGROUP, позволяющая установить все ресурсы системной платы, включая системный таймер, контроллеры прерываний и ПДП, математический сопроцессор и видеоконтроллер по умолчанию

3 Выполнение ранней инициализации чипа Super I/O, первый этап был выполнен на шагах алгоритма CFh и C0h

5 Установка начальных атрибутов видеосистемы.

Проверка флага состояния CMOS, его содержимое обнуляется

7 Сброс входного и выходного буферов контроллера клавиатуры (совместимого с ИМС 8042 или 8742). Контроллер входит в состав чипа Super I/O системной

платы. Самотестирование, инициализация контроллера клавиатуры. Разрешается подключение интерфейса клавиатуры

	Запрет подключения интерфейса компьютерной мыши PS/2.
	Определяется тип интерфейса клавиатуры (PS/2 или AT/DIN). Программируется
	контроллер клавиатуры. Разрешается использование клавиатуры
	Интерфейс PS/2-мыши еще запрещен.
	Для некоторых систем — определение портов, к которым подключены PS/2-клавиатура
	и мышь, что может вызвать переназначение портов
	Проверка теневого сегмента F000h циклами чтения и записи. Данная область
	будет использоваться для DMI и ESCD. Если проверка некорректна, то
	вырабатывается звуковой сигнал и код ошибки EFh выводится в порт 0080h
	Если записанные и считанные данные из сегмента F000h не совпадают,
	констатируется ошибка и выполнение POST останавливается

10 Определение типа установленной Flash BIOS. Проверка позволяет выбрать для BIOS соответствующую программу записи, с помощью которой загружается специальная команда Read Intelligent Identifier. Команда используется также процедурами модификации блоков ESCD и DMI, которые могут быть перезаписаны как при загрузке, так и после нее — при обращении приложений к функциям Plug and Play или DMI.

Код BIOS, выполняемый в рабочем сеансе, будет декодирован и переписан в область Run-time area (F000h).

Программирование регистров чипсета

12 Выполнение цепочки тестов CMOS. В часах RTC устанавливается режим питания. Ячейки CMOS используются в дальнейшем для хранения промежуточных результатов в ходе процедуры инициализации. В частности, в ячейки загружаются значения по умолчанию

14 Выполнение ранней инициализации чипсета. На первом этапе программируются ресурсы, недоступные разработчику системной платы. На втором этапе в регистры чипсета загружаются значения, изменяемые с помощью утилиты MODBIN. Становится возможной тонкая настройка ОЗУ и устройств PCI

16 Ранняя инициализация системного тактового генератора — установка значений по умолчанию

18 Определение параметров процессора: компании производителя, семейства, поколения, определение вида и объема кэша L1 и L2, типа SMI. Выполнение функции команды CPUID (коды и архитектура процессоров различных производителей отличаются).

Проверка регистров процессора, измерение тактовой частоты ядра процессора. После выполнения функции результат размещается в 128-разрядном слове, образованном ячейками регистров центрального процессора — EAX+EBX+ECX+EDX. Для расшифровки значения используемого кэша код сдвигается и перемещается в регистр AL

	Инициализация таблицы векторов прерываний (объем 1 024 байта, 256 типов
	прерываний). На данном этапе устанавливаются типы для 32 векторов (INT 00h-
	INT 1Fh), указывающих на процедуры BIOS.
	Выполнение проверок, направленных на обеспечение требований Y2K
	Проверка контрольной суммы CMOS и соответствия напряжения питания
	аккумулятора номиналу. Если выявлены ошибки — устанавливаются значения по
	умолчанию, задаваемые производителем системной платы

На данном этапе прием скан-кодов с клавиатуры и их обработка контроллером 8742 и процессором невозможны, поскольку запрещены прерывания, не подготовлена область данных BIOS, а клавиатура не инициализирована. Настройки Setup BIOS не должны противоречить выполнению последовательности POST

21 Инициализация системы Hardware Power Management для ноутбуков.

Формирование таблицы физических параметров, структуры для обслуживания автономного аккумуляторного питания, функций энергосбережения при работе жестких дисков, а также операций сохранения образа ОЗУ на диске

23 Обнаружение математического сопроцессора.

Проверка количества цилиндров — 40 или 80, а также типа установленного флоппи-диска.

Выполнение ранней инициализации чипсета.

Подготовка карты ресурсов BIOS, предназначенной для дальнейшей инсталляции устройств Plug and Play, а также УВВ на шине PCI

24 В процессорах поколений Intel P6 и P7 предусмотрена возможность организации доступа к памяти микропрограмм, в которой содержатся алгоритмы выполнения каждой машинной команды. На данном этапе в микрокод микропрограмм могут быть внесены изменения, позволяющие модернизировать алгоритмы или ввести новые микрокоды, предназначенные для новых машинных команд. Процедура обновления микрокода выполняется следующим образом.

• С помощью команды CPUID идентифицируется процессор и определяются его параметры — тип (Type), семейство (Family), модель (Model) и коэффициент умножения частоты (Stepping).

• Из модуля обновления микрокода, хранимого в BIOS, считывается нужный блок объемом 2 048 байт и распаковывается не в ОЗУ, а в SM RAM.

• Обновляется микрокод процессора.

Для некоторых процессоров Intel выполняется дополнительная идентификация. Обновляется карта распределения ресурсов

Инициализируются устройства Plug and Play. Информация о ресурсах, затребованных устройствами Plug and Play, обновляется на основании сканирования данных из CMOS, расширений BIOS, расположенных на шинах расширения УВВ, а также информации, хранящейся в блоке данных ESCD. Запись данных в ESCD откладывается на финальную стадию выполнения POST

25 Ранняя инициализация PCI. Перечисление устройств на шине. Назначение ресурсов ОЗУ и УВВ.

Поиск устройства видеосистемы, расширения BIOS и запись информации в область C000:0h (сегментный адрес в регистре CS:адрес смещения в регистре IP)

26 Настройка логики, обслуживающей линии Vendor Identification.

Завершение инициализации системного тактового генератора. Отключение синхронизации неиспользуемых слотов DIMM и PCI.

Инициализация системы мониторинга напряжений и температур, выполняемая в соответствии с типом системной платы

На данном этапе прием скан-кодов с клавиатуры и их обработка контроллером 8742 и процессором невозможны, поскольку запрещены прерывания, не подготовлена область данных BIOS, а клавиатура не инициализирована. Настройки Setup BIOS не должны противоречить выполнению последовательности POST

27 Разрешение прерывания INT 09h. Повторная инициализация контроллера клавиатуры на основе новых данных (таблицы векторов прерываний, инициализации чипсета).

Для BIOS формируется 16-символьный буфер ввода и устанавливается область памяти для полноценного функционирования

29 Программирование регистров MTRR процессора поколения Р6, а также инициализация контроллера APIC процессоров Pentium.

	Программирование чипсета (например, контроллера IDE) в соответствии
	с установками в CMOS.
	Измерение внутренней частоты процессора.
	Вызов расширения BIOS видеосистемы
	Инициализация модуля многоязычности.
	Посылка данных для отображения на экране дисплея (заставка Award, тип
	процессора и его скорость)
	Программирование чипа Super I/O
	Проверка битов маскирования канала 1 контроллера прерываний (совместимого

40 Проверка битов маскирования канала 2 контроллера прерываний (совместимого с ИМС 8259)

	Проверка функционирования контроллера прерываний (совместимого с ИМС 8259)
	Подсчет общей памяти проверкой каждого двойного слова в каждой странице 64 Кбайт.
	Запись программы, предназначенной для проверки процессоров семейства AMD
	Программирование регистров MTRR процессора семейства Syrix. Инициализация
	кэша L2 процессоров поколения P6, а также инициализация APIC для P6
	Инициализация шины USB
	Проверка всей памяти, очистка расширенной памяти

55 Для многопроцессорной платформы выполняется отображение числа процессоров

57 Отображение экрана логотипа Plug and Play. Ранняя инициализация устройств Plug and Play

59 Активизация ресурса антивирусной защиты — интегрированного антивирусного средства Trend Anti-Virus

60 Этап, позволяющий загрузить программу Setup.

До этой стадии POST вы должны успеть нажать соответствующую клавишу

65 Инициализация компьютерной мыши PS/2

67 Подготовка информации для адресного пространства, предназначенного для функции вызова: INT 15h (содержимое регистра AX=E820h)

На данном этапе прием скан-кодов с клавиатуры и их обработка контроллером 8742 и процессором невозможны, поскольку запрещены прерывания, не подготовлена область данных BIOS, а клавиатура не инициализирована. Настройки Setup BIOS не должны противоречить выполнению последовательности POST

	Включение кэша L2
	Программирование регистров чипсета в соответствии с элементами, описанными
	в Setup и в таблице автоконфигурирования
	Назначение ресурсов для всех устройств Plug and Play.
	Автоматическое распределение COM-портов для интегрированных устройств
	в том случае, если установлена опция Setup “AUTO”
	Инициализация контроллера флоппи-дисков.
	Дополнительная настройка регистров флоппи-диска

73 Факультативная функция ввода утилиты обновления BIOS AWDFLASH.EXE, если она находится на флоппи-диске и выбрана комбинация клавиш

75 Обнаружение и инсталляция всех IDE-устройств: жестких дисков, LS-120, ZIP, CD-R/RW, DVD и т.д.

Если обнаружена ошибка, выводится соответствующее сообщение, и программа ожидает нажатия клавиши.

Если ошибка не обнаружена или нажата клавиша , выполнение POST продолжается.

Очистка заставки с логотипом EPA или производителя

82 В зависимости от типа чипсета и системной платы в ОЗУ выделяется область для управления питанием.

В таблицу ESCD вносятся последние изменения, связанные с управлением питанием.

После снятия заставки с логотипом EPA видеорежим восстанавливается. Запрос пароля, если таковой предусмотрен установками CMOS

83 Восстановление данных из стека временного хранения в CMOS

84 Вывод на экран сообщения “Initializing Plugand Play Cards...” об обнаруженных ранее устройствах Plug and Play и параметрах

85 Завершение инициализации USB.

Определение порядка загрузки с жестких дисков SCSI

87 Переключение видеосистемы на текстовый режим работы.

Построение таблиц SYSID в области DNI согласно спецификации “System Management BIOS”.

Для обслуживания сетевых устройств создается идентификатор UUID (Universal Unique ID), а также идентификатор для загрузки с устройств Fire Wire IEEE 1394

На данном этапе все основные процедуры инициализации завершены. Выполняется подготовка к загрузке операционной системы, составляются необходимые для этого таблицы, формируются массивы, структуры

89 Если программой Setup предусмотрено использование протокола ACPI, в верхнюю область адресного пространства 4 Гбайт вставляются соответствующие таблицы

	Сканирование в пространстве PCI расширений BIOS, предназначенных для
	реализации протокола AOL (Alert On LAN). Инициализация средств AOL
	Разрешение использования логических средств поддержки немаскированного
	прерывания NMI.
	Разрешение использования контроля четности модулей ОЗУ
	Для горячего подключения мыши PS/2 разрешается линия IRQ 12.
	Обслуживание линии IRQ 11, нормализация параметров шумовых помех линий
	запросов прерываний

91 Подготовка условий для обслуживания жестких дисков в режиме Power Management. Операции подобного типа (Suspend to RAM) могут быть реализованы в рабочем сеансе операционной системы.

Установка переменных BIOS, хранящих базовые адреса последовательных и параллельных портов, которые располагают программами расширения BIOS

93 Подготовка к сохранению информации о разделах загрузочных устройств

94 Если Setup предусмотрена, включается кэш L2. Программируется параметр Boot Up Speed.

Завершение инициализации чипсета и системы управления питанием.

Снятие стартовой заставки BIOS, на экран монитора выводится таблица распределения ресурсов.

Настройка регистров процессоров семейства AMD K6. Завершающее обновление регистров процессоров семейства Intel P6.

Окончательная инициализация подсистемы удаленной загрузки Remote Pre Boot

95 Установка режима автоматического перехода на зимнее/летнее время Daylight Saving.

Программирование контроллера клавиатуры на число нажатий в секунду и время ожидания до входа в режим автоповтора.

Чтение идентификатора клавиатуры KBD ID.

Для 101-кнопочной клавиатуры устанавливается флаг NumLock в соответствии с информацией CMOS

96 Сохранение информации о разделах загрузочных устройств.

В многопроцессорных системах выполняется завершающая настройка системы, формируются служебные таблицы и поля, используемые в рабочем сеансе операционной системы.

Настройка регистров процессоров семейства Cyrix.

Заполнение и корректировка таблицы ESCD в соответствии с состоянием системы Power Management устройств Plug and Play и ATAPI.

Корректировка CMOS в соответствии с требованиями протокола Y2K.

Установка счетчика системных часов DOS Time в соответствии с показаниями RTC CMOS. Значение времени из формата “часы:минуты:секунды” пересчитывается

в такты (временные интервалы следования импульсов) интервального таймера 18,2 Гц и записывается в область переменных BIOS — DOS Time.

На данном этапе все основные процедуры инициализации завершены. Выполняется подготовка к загрузке операционной системы, составляются необходимые для этого таблицы, формируются массивы, структуры

Сохранение разделов устройств загрузки для дальнейшего использования интегрированными антивирусными средствами Trend Anti-Virus и Paragon Anti-Virus Protection.

Разрешение использования кэша L1.

На динамик системного блока генерируется звуковой сигнал окончания POST. Построение и сохранение таблицы MSIRQ.

Выполнение подготовки к загрузке операционной системы

FF Передача управления программе-загрузчику начального сектора BOOT. Выполнение прерывания BIOS INT 19h.

Вызванная подпрограмма позволяет (в соответствии с опцией меню BIOS Features Set Up программы Setup) опросить загрузочные устройства для поиска сектора загрузки. Для загрузки информация из сектора Цилиндр: 0, Головка: 0, Сектор:

1 считывается по адресу 07C0:0000h, после чего управление командой FAR JMP передается на начало этого блока

Выполнение программы, записанной в загрузочном секторе

ПРИМЕЧАНИЕ.

ECC (Error Correcting Code) — код коррекции ошибок применяется в модулях ОЗУ, способствуя повышению отказоустойчивости ПК. ECC позволяют исправить ошибку в одном разряде и обнаружить в двух разрядах. Поэтому компьютер, в памяти которого используются подобные коды, в случае ошибки в одном разряде может работать без прерывания, причем данные не будут искажены

BBSS (Boot Block Specification Signature) — метка сигнатуры спецификации загрузочного блока.

SMI (System Management Interrupt) — аппаратное обеспечение, интегрированное в процессор, предназначенное для управления потребляемой мощностью. Для обслуживания этих компонентов используется высокоприоритетное прерывание.

Y2K — требования, предъявляемые к коммерческим продуктам компьютерных систем для обеспечения функциональной совместимости, функциональности и прочих параметров, имевших место до и после 2000 года.

DMI (Desktop Management Interface) — протокол, позволяющий обеспечить взаимодействие программных средств с компонентами системных плат.

MTRR (Memory Type Range Registers) — регистры процессоров поколений P6 и P7, в которые заносятся данные, описывающие свойства областей памяти и определяющие тип кэши-рования памяти.

APIC ( Advanced Programmable Interruption Controller) — усовершенствованный программируемый контроллер прерываний , входящий в состав чипсета. Процессор поколения P6 также располагает подобным контроллером для мультипроцессорного применения.

MSIRQ (Microsoft IRQ Routing Map) — таблица карты распределения прерываний , стандартизирована Microsoft.

SM RAM (System Management RAM) — одно из названий оперативной регистровой памяти небольшой емкости, предусмотренной в архитектуре процессоров, начиная с Pentium Pro и выше, предназначенной для хранения служебных данных.

В случае неадекватного завершения каждого из процессов алгоритм переходит на обра ботку особого случая, и POST BIOS Medallion генерирует коды, отмеченные ниже:

POST- коды особых случаев Award BIOS V 6.0 Medallion

Код системных событий (System Events codes)

Код, активизируемый при обслуживании компонентов APM или ACPI (Power Management Debug codes)

	Энергосбережение с отключением напряжения питания +12 В
	Переход в режим работы с минимальным энергопотреблением
	Прерывание для выхода из режима энергосбережения по событию
	Переход процессора в режим энергосбережения путем снижения его тактовой
	Переход в режим частичного энергосбережения с использованием технологии ACPI
	Использование компонента SMI для перехода в режим энергосбережения
	Переход процессора в режим энергосбережения с использованием технологии APM
	Переход системы в режим энергосбережения с использованием технологии APM
	Перевод системы в режим полного энергосбережения

Сообщение о фатальных ошибках выполнения операций (System Error codes)

	Ошибка обработки кода ECC
	Ошибка жесткого диска при возврате из режима энергосбережения
	Несовпадение данных при записи в сегмент F000h и считывании из него

Для сокращения времени прохождения тестовой программы POST Award BIOS вы можете воспользоваться опцией Quick Power On Self Test, которую можно обнаружить в программе Setup. В этом случае запускается модифицированная версия теста Award Software, которая, в отличие от полной версии программы, выполняется быстро.

Коды контрольных точек POST AMI BIOS 8 V1.4

Представление о дисплее кодов контрольных точек

Для отображения контрольных точек POST AMI BIOS применяются диагностические платы POST Diagnostic Card, индикаторы на системных платах, а также дисплеи контроль ных точек AMI BIOS Checkpoint Display .

Дисплей представляет собой строку кода в нижнем правом углу экрана монитора, отобра жаемую во время прохождения POST

Недостаток использования дисплея кодов контрольных точек состоит в невозможности при-менения этого метода при отключенной видеосистеме.

Назначение диспетчера инициализации устройст

В различные периоды тестирования POST управление передается специальной про грамме диспетчеру инициализации устройств DIM (Device Initialization Manager).

Эта программа получает управление от BIOS в том случае, если необходимо проверить сис темные или локальные шины компьютера. Существует несколько контрольных точек POST, предназначенных для запуска этой программы.

2Ah инициализация устройств на системной шине.

38h инициализация устройств IPL.

39h индикация ошибок при инициализации шин.

95h инициализация шин, управляемых расширениями BIOS.

DEh — ошибка конфигурации ОЗУ.

DFh — ошибка конфигурации ОЗУ.

Сообщения, генерируемые DIM, также выводятся в диагностический порт 80h и хранятся в информационном слове в процессе выполнения проверки.

Слово, в котором хранится отмеченная информация, содержит младший байт, совпадаю щий с системным POST кодом. Старший байт делится на две тетрады. Ниже представлено описание кодов, загружаемых в тетрады.

Поля старшей тетрады.

Инициализация всех устройств на интересующих шинах запрещена.

Инициализация статических устройств на интересующих шинах.

Инициализация устройств вывода информации на интересующих шинах.

Инициализация устройств ввода информации на интересующих шинах.

Инициализация устройств системной загрузки (IPL) на интересующих шинах.

Инициализация устройств общего назначения на интересующих шинах.

Сообщение об ошибках для интересующих шин.

Инициализация устройств, управляемых расширениями BIOS (для всех шин).

Инициализация загрузочных расширений BIOS, соответствующих BIOS Boot Specification (для всех шин).

Младшая тетрада.

Системные процедуры инициализации (DIM).

Шины подключения интегрированных системных устройств.

Шина ISA Plug and Play.

Шина PCMCIA.

В том случае, если обнаружена ошибка конфигурации ОЗУ, в диагностический порт вы водится циклическая последовательность кодов DEh, DFh и контрольных точек конфигура ции, которые могут принимать следующие значения.

00 ОЗУ не обнаружено.

01 установлены модули DIMM различных типов.

02 чтение из узла SPD (Serial Presence Detect) модуля DIMM произведено неудачно.

03 модуль DIMM не может быть использован на данной частоте.

04 модуль DIMM не может быть использован в данной системе.

05 ошибка в младшей странице памяти.

Сокращенная процедура выполняется при установке в BIOS параметра Quick Power On Self Test.

• 65 Сбрасывается видеоадаптер. Инициализируются звуковой контроллер, устройства ввода/вывода,тестируется клавиатура и мышь. Проверяется целостность BIOS
• 66 Инициализируется кэш-память. Создается таблица векторов прерываний. Инициализируется система управления питанием
• 67 Проверяется контрольная сумма CMOS и тестируется батарейка питания. Настраивается чипсет на основе параметров CMOS
• 68 Инициализируется видеоадаптер
• 69 Настраивается контроллер прерываний
• 6A Тестируется оперативная память (ускоренно)
• 6B Отображается логотип EPA, результаты тестов процессора и памяти
• 70 Отображается подсказка для входа в BIOS Setup. Инициализируется мышь, подключенная к PS/2 или USB
• 71 Инициализируется контроллер кэш-памяти
• 72 Настраиваются регистры чипсета. Создается список устройств Plug and Play.& Инициализируется контроллер дисковода
• 73 Инициализируется контроллер жестких дисков
• 74 Инициализируется сопроцессор
• 75 Если нужно, жесткий диск защищается от записи
• 77 Если нужно, запрашивается пароль и выводятся сообщения Press F1 to continue, DEL to enter Setup
• 78 Инициализируются платы расширения с собственной BIOS
• 79 Инициализируются ресурсы платформы
• 7A Генерируются корневая таблица RSDT, таблицы устройств DSDT, FADT и т. п.
• 7D Собирается информациия о разделах загрузочных устройств
• 7E BIOS готовится к загрузке операционной системы
• 7F Состояние индикатора NumLock устанавливается в соответствии с настройками
• BIOS Setup
• 80 Вызывается INT 19 и запускается операционная система

AMIBIOS 8.0

• D0 Инициализация процессора и чипсета. Проверка контрольных сумм загрузочного блока BIOS
• D1 Начальная инициализация портов ввода/вывода. Контроллеру клавиатуры передается команда для самотестирования BAT
• D2 Запрет кэш-памяти L1/L2. Определяется объем установленной ОЗУ
• D3 Настраиваются схемы регенерации памяти. Разрешается использовать кэш-память
• D4 Тест 512 Кбайт памяти. Устанавливается стек и назначается протокол обмена с кэш-памятью
• D5 Код BIOS распаковывается и копируется в теневую память
• D6 Проверяются контрольные суммы BIOS и нажатие клавиш Ctrl+Home (восстановление BIOS)
• D7 Управление передается интерфейсному модулю, распаковывающему код в область Run-Time
• D8 Выполняемый код распаковывается из flash-памяти в оперативную. Сохраняется информация CPUID
• D9 Распакованный код переносится из области временного хранения в сегменты 0E000h и 0F000h ОЗУ
• DA Восстанавливаются регистры CPUID. Выполнение POST переносится в оперативную память
• E1-E8, EC-EE Ошибки, связанные с конфигурацией системной памяти
• 03 Запрещается обработка NMI, ошибок четности, выдача сигналов на монитор. Резервируется область для журнала событий GPNV, устанавливаются начальные значения переменных из BIOS
• 04 Проверяется работоспособность батареи и подсчитывается контрольная сумма CMOS
• 05 Инициализируется контроллер прерываний и строится таблица векторов
• 06 Тестируется и готовится к работе таймер
• 08 Тестируется клавиатура (мигают индикаторы клавиатуры)
• C0 Начальная инициализация процессора. Запрещается использовать кэш-память. Определяется APIC
• C1 Для многопроцессорных систем определяется процессор, отвечающий за запуск системы
• C2 Завершается назначение процессора для запуска системы. Идентификация с помощью CPUID
• C5 Определяется количество процессоров, настраиваются их параметры
• C6 Инициализируется кэш-память для более быстрого прохождения POST
• C7 Завершается начальная инициализация процессора
• 0A Определяется контроллер клавиатуры
• 0B Поиск мыши, подключенной к порту PS/2
• 0C Проверяется наличие клавиатуры
• 0E Детектируются и инициализируются различные устройства ввода
• 13 Начальная инициализация регистров чипсета
• 24 Распаковываются и инициализируются модули BIOS, специфические для платформы.
• Создается таблица векторов прерываний и инициализируется обработка прерываний
• 2A С помощью механизма DIM определяются устройства на локальных шинах. Готовится к инициализации видеоадаптер, строится таблица распределения ресурсов
• 2C Обнаружение и инициализация видеоадаптера, видеоадаптер вызывается BIOS
• 2E Поиск и инициализация дополнительных устройств ввода/вывода
• 30 Готовится к обработке SMI
• 31 Инициализируется и активизируется модуль ADM
• 33 Инициализируется модуль упрощенной загрузки
• 37 Отображается логотип AMI, версия BIOS, процессора, подсказка клавиши для входа в BIOS
• 38 С помощью DIM инициализируются различные устройства на локальных шинах
• 39 Инициализируется контроллер DMA
• 3A Устанавливается системное время в соответствии с показаниями часов RTC
• 3B Тестируется оперативная память и отображаются результаты
• 3C Настраиваются регистры чипсета
• 40 Инициализируются последовательные и параллельные порты, математический сопроцессор и др.
• 52 По результатам теста памяти обновляются данные об ОЗУ в CMOS
• 60 По BIOS Setup устанавливается состояние NumLock и настраиваются параметры автоповтора
• 75 Запускается процедура для работы с дисковыми устройствами (прерывание INT 13h)
• 7C Создаются и записываются в NVRAM таблицы расширенной системной конфигурации ESCD
• 84 Регистрация ошибок, обнаруженных при выполнении POST
• 85 Выводятся сообщения об обнаруженных некритических ошибках.
• 87 Если нужно, запускается BIOS Setup, которая предварительно распаковывается в ОЗУ
• 8C В соответствии с BIOS Setup настраиваются регистры чипсета
• 8D Строятся таблицы ACPI
• 8E Настраивается обслуживание немаскируемых прерываний (NMI)
• 90 Окончательно инициализируется SMI
• A1 Очистка данных, которые не нужны при загрузке операционной системы
• A2 Для взаимодействия с операционной системой готовятся модули EFI
• A4 В соответствии с BIOS Setup инициализируется языковой модуль
• A7 Выводится итоговая таблица процедуры POST
• A8 Устанавливается состояние регистров MTRR
• A9 Если нужно, выполняется ожидание ввода команд с клавиатуры
• AA Удаляются векторы прерываний POST (INT 1Ch и INT 09h)
• AB Определяются устройства для загрузки операционной системы
• AC Завершающие этапы настройки чипсета в соответствии с BIOS Setup
• B1 Настраивается интерфейс ACPI

PhoenixBIOS 4.0

• 02 Verify Real Mode
• 03 Disable Non-Maskable Interrupt (NMI)
• 04 Get CPU type
• 06 Initialize system hardware
• 08 Initialize chipset with initial POST values
• 09 Set IN POST flag
• 0A Initialize CPU registers
• 0B Enable CPU cache
• 0C Initialize caches to initial POST values
• 0E Initialize I/O component
• 0F Initialize the local bus IDE
• 10 Initialize Power Management
• 11 Load alternate registers with initial POST values
• 12 Restore CPU control word during warm boot
• 13 Initialize PCI Bus Mastering devices
• 14 Initialize keyboard controller
• 16 (1-2-2-3) BIOS ROM checksum
• 17 Initialize cache before memory autosize
• 18 8254 timer initialization
• 1A 8237 DMA controller initialization
• 1C Reset Programmable Interrupt Controller
• 20 (1-3-1-1) Test DRAM refresh
• 22 (1-3-1-3) Test 8742 Keyboard Controller
• 24 Set ES segment register to 4 GB
• 26 Enable A20 line
• 28 Autosize DRAM
• 29 Initialize POST Memory Manager
• 2A Clear 512 KB base RAM
• 2C (1-3-4-1) RAM failure on address line xxxx
• 2E (1-3-4-3) RAM failure on data bits xxxx of low byte of memory bus
• 2F Enable cache before system BIOS shadow
• 30 (1-4-1-1) RAM failure on data bits xxxx of high byte of memory bus
• 32 Test CPU bus-clock frequency
• 33 Initialize Phoenix Dispatch Manager
• 34 Disable Power Button during POST
• 35 Re-initialize registers
• 36 Warm start shut down
• 37 Re-initialize chipset
• 38 Shadow system BIOS ROM
• 39 Re-initialize cache
• 3A Autosize cache
• 3C Advanced configuration of chipset registers
• 3D Load alternate registers with CMOS values
• 40 CPU speed detection
• 42 Initialize interrupt vectors
• 45 POST device initialization
• 46 (2-1-2-3) Check ROM copyright notice
• 48 Check video configuration against CMOS
• 49 Initialize PCI bus and devices
• 4A Initialize all video adapters in system
• 4B QuietBoot start (optional)
• 4C Shadow video BIOS ROM
• 4E Display BIOS copyright notice
• 50 Display CPU type and speed
• 51 Initialize EISA board
• 52 Test keyboard Тестируется клавиатура
• 54 Set key click if enabled
• 55 Initialize USB bus
• 58 (2-2-3-1) Test for unexpected interrupts
• 59 Initialize POST display service
• 5A Display prompt “Press F2 to enter SETUP”
• 5B Disable CPU cache
• 5C Test RAM between 512 and 640 KB
• 60 Test extended memory
• 62 Test extended memory address lines
• 64 Jump to UserPatch1
• 66 Configure advanced cache registers
• 67 Initialize Multi Processor APIC
• 68 Enable external and CPU caches
• 69 Setup System Management Mode (SMM) area
• 6A Display external L2 cache size
• 6B Load custom defaults (optional)
• 6C Display shadow-area message
• 6E Display possible high address for UMB recovery
• 70 Display error messages Выводятся сообщения об ошибках
• 72 Check for configuration errors
• 76 Check for keyboard errors
• 7C Set up hardware interrupt vectors
• 7D Initialize hardware monitoring
• 7E Initialize coprocessor if present
• 80 Disable onboard Super I/O ports and IRQs
• 81 Late POST device initialization
• 82 Detect and install external RS232 ports
• 83 Configure non-MCD IDE controllers
• 84 Detect and install external parallel ports
• 85 Initialize PC-compatible PnP ISA devices
• 86 Re-initialize onboard I/O ports
• 87 Configure Motheboard Configurable Devices (optional)
• 88 Initialize BIOS Data Area
• 89 Enable Non-Maskable Interrupts (NMIs)
• 8A Initialize Extended BIOS Data Area
• 8B Test and initialize PS/2 mouse
• 8C Initialize floppy controller
• 8F Determine number of ATA drives (optional)
• 90 Initialize hard-disk controllers
• 91 Initialize local-bus harddisk controllers
• 92 Jump to UserPatch2
• 93 Build MPTABLE for multi-processor boards
• 95 Install CD ROM for boot
• 96 Clear huge ES segment register
• 97 Fixup Multi Processor table
• 98 (1-2) Search for option ROMs. One long, two short beeps on checksum failure
• 99 Check for SMART Drive (optional)
• 9A Shadow option ROMs
• 9C Set up Power Management
• 9D Initialize security engine (optional)
• 9E Enable hardware interrupts
• 9F Determine number of ATA and SCSI drives
• A0 Set time of day
• A2 Check key lock
• A4 Initialize Typematic rate
• A8 Erase F2 prompt
• AA Scan for F2 key stroke
• AC Enter SETUP
• AE Clear Boot flag
• B0 Check for errors
• B2 POST done - prepare to boot operating system
• B4 (1) One short beep before boot
• B5 Terminate QuietBoot (optional)
• B6 Check password (optional)
• B9 Prepare Boot
• BA Initialize DMI parameters
• BB Initialize PnP Option ROMs
• BC Clear parity checkers
• BD Display MultiBoot menu
• BE Clear screen (optional)
• BF Check virus and backup reminders
• C0 Try to boot with INT 19
• C1 Initialize POST Error Manager (PEM)
• C2 Initialize error logging
• C3 Initialize error display function
• C4 Initialize system error handler
• C5 PnPnd dual CMOS (optional)
• C6 Initialize notebook docking (optional)
• C7 Initialize notebook docking late
• D2 Unknown interrupt
• E0 Initialize the chipset
• E1 Initialize the bridge
• E2 Initialize the CPU
• E3 Initialize system timer
• E4 Initialize system I/O
• E5 Check force recovery boot
• E6 Checksum BIOS ROM
• E7 Go to BIOS
• E8 Set Huge Segment
• E9 Initialize Multi Processor
• EA Initialize OEM special code
• EB Initialize PIC and DMA
• EC Initialize Memory type
• ED Initialize Memory size
• EE Shadow Boot Block
• EF System memory test
• F0 Initialize interrupt vectors
• F1 Initialize Real Time Clock
• F2 Initialize video
• F3 Initialize System Management Mode
• F4 (1) Output one beep before boot
• F5 Boot to Mini DOS
• F6 Clear Huge Segment
• F7 Boot to Full DOS

Любой ремонтник компьютеров знает, что POST Card PCI применяется для диагностики неисправностей при ремонте и модернизации компьютеров типа IBM PC (или совместимых с ним).

Такие карты в России и СНГ производит несколько компаний: Мастер Кит (Москва), e-KIT Post Cards, ACE Lab (Н.Новгород), BVG Group (Москва), ЕПОС: PCI TESTCARD (Украина), IC Book: IC80 (Украина), Jelezo: Jpost Full (Украина), VL Comp: PC Analyzer (Белорусия). Есть и зарубежные решения, но у нас их не найти в свободной продаже.

POST Card PCI представляет собой плату расширения компьютера, которая может быть установлена в любой свободный PCI слот (33 МГц) и предназначена для отображения POST кодов, генерируемых BIOS"ом компьютера, в удобном для пользователя виде.

Условно все POST-карты можно разделит на серийные и внесерийные (комплекты для самостоятельной сборки).

Обзор существующих POST-карт

Рассмотрим недостатки POST-карт различных производителей.

Родоначальником производства PCI POST-карт в России считается компания ACE Lab, которая имеет большой опsn в производстве программно-аппаратных комплексов для диагностики и реионта компьютеров.

Мастер Кит POST Card PCI NM9221 (набор для самостоятельной сборки)/BM9221 (готовая плата). Один недостаток — семисегментный индикатор смотрит «мордой вниз».

Достоинства данной POST Card: собрана на ПЛИС серии EPM3XXX, поддерживающей Hot-socketing (более надежна, так как меньше вероятность сжечь POST Card) и работающей на 3.3V (лучше совместимость с современными спецификациями PCI2.3 и PCI3.0), поддержка новых и старых чипсетов благодаря сменным прошивкам.

e-Kit_02 Недостатки данной POST Card: собрана на ПЛИС устаревшей серии EPM7XXX, не поддерживающей Hot-socketing (менее надежна, так как больше вероятность сжечь POST Card) и работающей на 5.0V (могут быть проблемы с современными PCI2.3 и PCI3.0).

ACE Lab PC-POST PCI-2 . Не удобно, что индикатор смотрит вниз, зато есть возможность выбрать один из 4х возможных портов, откуда будет считываться информация.

ACE Lab PC POWER PCI-2 — полнофункциональный программно — аппаратный комплекс, который позволяет выполнять ряд диагностических тестов, запускаемых из установленного на плате ПЗУ, ориентированных на выявление системных ошибок и конфликтов оборудования.

BVG Group Dual POST . Достоинства: простая и дешевая ПОСТ-карточка. Сделана на базе ПЛИС Altera EPM3032ALC44-10. Несет на себе пять светодиодов (питание на PCI — -12V, +12V, +3.3V, +5V, и сигнал RESET) и два семисегментных индикатора с обоих сторон платы. Индикатор может показывать одну цифру — это значит, что на PCI слот, в который вставлена эта ПОСТка, тактирование не приходит.

Характерным недостатком данной карточки из-за её урезанности является снятие тактирования со слота PCI, в который установлена эта карточка после этапа POST, на котором происходит инициализация генератора (для Award BIOS — 26h), в результате чего посткоды перестают отображаться. Методы «борьбы» с этой болезнью следующие:

• Если в BIOS Setup присутствует пункт Detect DIMM/PCI Clock — перевод оного в Disable не даст генератору снять частоту с неиспользуемых слотов, в результате чего Dual POST будет работать «как нормальная» ;) , показывая все «полагающиеся» посткоды.
• Если проверяемая плата имеет Sharing PCI Slots (обычно — дальние от процессора два разъема, у которых одно прерывание «на двоих»), то можно в один из них вставить любое «нормальное» PCI-устройство (видео, звуковую, сетевую и т.п.), а в другой — посткарточку. При инициализации генератор, увидев «полноценное» PCI-устройство на Sharing PCI Slots — часто (зависит от конкретной платы-биоса) не снимает тактирование с обоих, чем с успехом «воспользуется» Dual POST.

BVG Group POST Pro. Вместо семисегментников используется ЖК-дисплей с бегущей строкой, но стоимость карты при этом около 300 у.е., что неоправданно высоко.

ЕПОС: PCI TESTCARD. Продвинутая серия «Master» из полезных «наворотов» по большому счету позволяет дополнительно лишь выбирать переключателями на плате диагностический порт в диапазоне 0-3FFh, который используется для вывода POST-кодов. Недостатки данной POST Card: собрана на ПЛИС устаревшей серии EPM7XXX, не поддерживающей Hot-socketing (менее надежна, так как больше вероятность сжечь POST Card) и работающей на 5.0V (могут быть проблемы с современными PCI2.3 и PCI3.0). Имеется также информация о выводе неверных POST кодов на некоторых материнских платах.

IC Book: IC80 . Известный представитель «взрослых» посткарточек, отличительной особенностью которого является присутствие не только «наворотов» в области мониторинга, но также и уникальные (не имеющие аналогов) возможности по отладке системы в пошаговом режиме. Плата имеет несколько отличительных особенностей:

• Выбор адресов, используемых в целях диагностики: 80h/81h и 84h/85h, 378h, 1080h
• Вывод диагностических кодов выполняется на два индикатора
• Вывод информации на внешний индикатор
• Индикация напряжения Stand-By 3.3V
• Поддержка четности на шине PCI
• Поддержка серверных вариантов шины PCI

Небольшой недостаток: не совсем корректно работает пошаговый режим на новых платах.

Jelezo: Jpost Full. Зависает на некоторых материнках (в основном GIGABYTE) в чёрный экран после первой перезагрузки.

VL Comp: PC Analyzer . Простенький и дешевый пост-контроллер, изюминкой которого является совмещение в одном конструктиве сразу двух типов посткарточек — для ISA и для PCI.

POST Card PCI BM9222 с ЖК-диплеем

Сегодня мы рассмотрим PCI POST-карту нового поколения POST Card PCI BM9222 производства московской компании Маскер Кит.

Технические характеристики

• Напряжение питания: +5 В.
• Ток потребления, не более: 100 мА.
• Частота шины PCI: 33 МГц.
• Адрес диагностического порта: 0080h
• Индикация POST кодов: на ЖК-дисплее в две строки по 16 символов (первая строка – POST-код в шестнадцатеричном виде и через тире — тип БИОСа, вторая строка – описание ошибки в виде бегущей строки).
• Индикация сигналов PCI шины: светодиоды на лицевой стороне платы — RST (сигнал сброса PCI) и
• CLK (тактовый сигнал PCI).
• Индикаторы наличия напряжений питания PCI шины: +5V, +12V, -12V, +3,3V.
• Совместимость с материнскими платами чип-сетах: Intel, VIA, SIS.
• Размер печатной платы: 95.5 x 73.6 мм.

Конструкция

Конструктивно POST Card PCI выполнен на двусторонней печатной плате из фольгированного стеклотекстолита с размерами 95.5 x 73.6 мм. В целях улучшения электропроводности контактов устройства, ламели покрыты никелем.

Принцип работы POST Card PCI

При каждом включении питания компьютера, совместимого с IBM PC, и до начала загрузки операционной системы процессор компьютера выполняет процедуру BIOS под названием «Самотест по включению питания» — POST (Power On Self Test). Эта же процедура выполняется также при нажатии на кнопку RESET или при программной перезагрузке компьютера. Во избежание недоразумений здесь следует отметить, что в некоторых особых случаях с целью сокращения времени загрузки компьютера процедура POST может быть несколько урезана, например, в режиме «Quick Boot» или при выходе из режима «сна» Hibernate.

Основной целью процедуры POST является проверка базовых функций и подсистем компьютера (таких как память, процессор, материнская плата, видеоконтроллер, клавиатура, гибкий и жесткий диски и т. д.) перед загрузкой операционной системы. Это в некоторой степени застраховывает пользователя от попытки работать на неисправной системе, что могло бы привести, например, к разрушению пользовательских данных на HDD. Перед началом каждого из тестов процедура POST генерирует так называемый POST код, который выводится по определенному адресу в пространстве адресов устройств ввода/вывода компьютера. В случае обнаружения неисправности в тестируемом устройстве процедура POST просто «зависает», а предварительно выведенный POST код однозначно определяет, на каком из тестов произошло «зависание». Таким образом, глубина и точность диагностики при помощи POST кодов полностью определяется глубиной и точностью тестов соответствующей процедуры POST BIOS"а компьютера.

Следует отметить, что таблицы POST кодов различны для различных производителей BIOS и, в связи с появлением новых тестируемых устройств и чипсетов, несколько отличаются даже для различных версий одного и того же производителя BIOS. Таблицы POST кодов можно найти на соответствующих сайтах производителей BIOS: для AMI это http://www.ami.com , для AWARD — http://www.award.com , иногда таблицы POST кодов приводятся в руководствах к материнским платам.

Для отображения POST кодов в удобном для пользователя виде служат устройства под названием POST Card. Предлагаемая POST Card для шины PCI — это плата расширения компьютера, вставляемая (при выключенном питании!) в любой свободный PCI слот (33 МГц) и имеющая текстовый индикатор для отображения POST кодов и текстовой информации о текущем коде. Из особенностей работы данной POST Card хочется отметить то, что после включения питания компьютера и до появления первого активного сигнала RESET PCI на индикатор POST Card выводится сообщение приветствия “BM9222 MASTERKIT POSTCARD”.

Кроме того, на POST Card имеются светодиоды, отражающие состояния сигналов CLK и RST шины PCI.

Поиск неисправностей при помощи POST Card PCI

Последовательность действий при ремонте компьютера с использованием POST Card выглядит следующим образом:

1. Выключаем питание неисправного компьютера.
2. Устанавливаем POST Card в любой свободный PCI слот материнской платы.
3. Включаем питание компьютера.
4. При необходимости подстраиваем контрастность (при установке LCD экрана, для PLED – подстройка не требуется) изображения путем нажатия на кнопки (дальняя от материнской платы кнопка увеличивает контрастность, ближняя — уменьшает) или изменяем тип отображаемого БИОСа – путем нажатия и удерживания одной из кнопок и нажатия на вторую (после отжатия кнопок смениться тип БИОСа, отображаемый в первой строке индикатора после кода ошибки). Все вышеперечисленные настройки сохраняются при отключении питания и загружаются при следующей подаче напряжения на POST Card.
5. Читаем информацию на индикаторе POST Card – это POST код, на котором «зависает» загрузка компьютера, и его описание во второй строке.
6. Осмысливаем вероятные причины.
7. При выключенном питании производим перестановки шлейфов, модулей памяти и других компонентов с целью устранить неисправность.
8. Повторяем пункты 3-7, добиваясь устойчивого прохождения процедуры POST и начала загрузки операционной системы.
9. При помощи программных утилит производим окончательное тестирование аппаратных компонентов, а в случае плавающих ошибок — осуществляем длительный прогон соответствующих программных тестов.

При ремонте компьютера без использования POST Сard пункты 3-6 этой последовательности просто опускают и со стороны ремонт компьютера выглядит просто как лихорадочная перестановка памяти, процессора, карт расширения, блока питания, и в довершение всего — материнской платы.

Если в крупных фирмах имеется большой запас исправных комплектующих, то для мелких фирм и частных лиц ремонт компьютера путем установки заведомо исправных компонентов превращается в сложную проблему.

Как же на практике осуществляется ремонт компьютера с использованием POST-Card?

Прежде всего, при включении питания перед началом работы процедуры POST должен произойти сброс системы сигналом RST (RESET), что индицируется на POST Card сменой сообщения приветствия на другие сообщения POST Card. Если смены не происходит в течение 2-4 секунд (время отображения приветствия примерно 0.7 сек) или появилось одно из сообщений “NO CODES” или “RESET” на более чем 1 сек, то в этом случае рекомендуется немедленно выключить компьютер, вытащить все платы и кабели, а также модули памяти из материнской платы. В системном блоке необходимо оставить подключенной к блоку питания материнскую плату с установленным процессором и плату POST Card. Если при последующем включении компьютера нормально проходит сброс системы и появляются первые POST коды, то, очевидно, проблема заключается во временно извлеченных компонентах компьютера; возможно также, в неправильно подключенных шлейфах. Вставляя последовательно память, видеоадаптер, а затем и другие карты, и наблюдая за POST кодами на индикаторе, обнаруживают неисправный модуль.

Вернемся теперь к случаю, когда даже не проходит начальный сброс системы (на индикаторе POST Card не происходит смена сообщения приветствия другими сообщениями). В этом случае либо неисправен блок питания компьютера, либо сама материнская плата (неисправны цепи формирования сигнала RESET) или процессор не стартует. Точную причину можно установить, подсоединив к материнской плате заведомо исправный блок питания.

Рассмотрим теперь случай, когда сигнал сброса проходит, но никакие POST коды на индикатор не выводятся (удерживается сообщение “NO CODES”); при этом, как было описано ранее, тестируется система, состоящая только из материнской платы, процессора, POST Card и блока питания. Если материнская плата совершенно новая, то причина может быть заключена в неправильно установленных джамперах материнской платы. Если все джамперы и процессор установлены правильно, а материнская плата все же не запускается, следует заменить процессор на заведомо исправный. Если же и это не помогает, то можно сделать вывод о неисправности материнской платы либо ее компонентов (например, причиной неисправности может являться повреждение информация в FLASH BIOS).

Главным достоинством POST Card является то, что она не требует для своей работы монитор. При этом тестирование компьютера при помощи POST Card возможно на ранних этапах процедуры POST, когда еще не доступна звуковая диагностика. Еще одна немаловажная особенность – отображение POST-кодов на всех типах БИОСов, выводящих коды по адресу 0×0080), но не описанных в ПЗУ.

PLED индикатор

Данное устройство проверки комплектуется индикатором с отображающим элементом типа PLED. Преимущества такого типа дисплея в том, что он обладает высокой контрастностью и широким углом обзора – это очень важно потому что часто POST-плату приходится устанавливать в компьютер в корпусе, когда в соседних слотах установлены другие платы (сетевые, звуковые и пр.).

Многоязыковая поддержка

POST-карта позволяет выводить коды для различных типов БИОСов на различных языках (английский и русский по умолчанию). Смена типа БИОСа осуществляется путем одновременного нажания сразу обеих кнопок. Данная пост карта расшифровывает 3 вида БИОСов в 2 языках (всего 6 типов). Русифицированный БИОС в названии содержит строку “RU”.

Сами строки с описанием кодов располагаются с микросхеме 24С256 — 32кБ SEEPROM. Эта микросхема установлена в панельку, и опытные пользователи могут извлечь её и перепрограммировать другой (более новой или с другим языком) версией в случае её появления на сайте www.masterkit.ru. Обновление происходит регулярно, с отслеживанием тенденций развития компьютерной техники.

В случае если данный код не дешифрируется в вашей версии, то следует воспользоваться Интернетом для оперативного поиска расшифровки типа теста, а так же написать в компанию МастерКит письмо с указанием данного случая, и в последующей версии данный код будет уже включен.

Для перепрограммирования можно воспользоваться набором NM9215 (программатор) совместно с переходником на данный тип микросхем NM9216/4.

Проверка системного блока РС тестером Post Card PCI на практике

Последовательность тестирования компонентов компьютера следующая:

1. Тестирование процессора.
2. Проверка контрольной суммы ROM BIOS.
3. Проверка и инициализация контроллеров DMA, IRQ и таймера 8254.
После этой стадии становится доступной звуковая диагностика.
4. Проверка операций регенерации памяти.
5. Тестирование первых 64 КБ памяти.
6. Загрузка векторов прерываний.
7. Инициализация видеоконтроллера.
После этого этапа диагностические сообщения выводятся на экран.
8. Тестирование полного объема ОЗУ.
9. Тестирование клавиатуры.
10. Тестирование CMOS памяти.
11. Инициализация COM и LPT портов.
12. Инициализация и тест контроллера FDD.
13. Инициализация и тест контроллера HDD.
14. Поиск дополнительных модулей ROM BIOS и их инициализация.
15. Вызов загрузчика операционной системы (INT 19h, Bootstrap), при невозможности загрузки операционной системы- попытка запуска ROM BASIC (INT 18h); при неудаче- останов системы (HALT).

Прохождение тестов

При прохождении каждого из тестов POST генерирует POST-код, который записывается в специальный диагностический регистр. Информация, содержащаяся в диагностическом регистре, становится доступной для наблюдения при установке в свободный слот компьютера диагностической платы POST Card и отображается на семисегментном индикаторе в виде двух шестнадцатиричных цифр. Адрес диагностического регистра зависит от типа компьютера, в более старых версиях это: ISA, EISA- 80h, ISA-Compaq- 84h, ISA-PS/2- 90h, MCA-PS/2- 680h, 80h, некоторые EISA- 300h.

Прежде всего, необходимо определить фирму-производителя BIOS материнской платы. Это можно сделать либо по наклейке на микросхеме BIOS, либо по надписям, которые выводятся на экран аналогичной исправной материнской платой. В России и СНГ наиболее распространенными являются BIOS фирм AMI и AWARD. С приобретением некоторого опыта уже по первым POST кодам можно с уверенностью назвать производителя BIOS.

Таблицы POST кодов различны для различных производителей BIOS и, в связи с появлением новых тестируемых устройств и чипсетов, отличаются даже для различных версий одного и того же производителя BIOS.

Исторически сложилось, что значения POST кодов в соответствующих таблицах производителей BIOSов даются в виде шестнадцатиричных чисел в диапазоне 00h- FFh (0- 255 в десятичной системе счисления), поэтому для удобства использования таких таблиц необходимо обеспечить отображение POST кодов в шестнадцатеричном виде.

Коды неисправностей

Award Software International, Inc.

AwardBIOS V4.51PG Elite

Динамично развивающаяся компания Award Software в 1995 году предложила новое на то время решение в области низкоуровневого программного обеспечения AwardBIOS «Elite», более известное как V4.50PG. Режим обслуживания контрольных точек не изменился ни в широко распространенной версии V4.51, ни в раритетном исполнении V4.60. Суффиксы P и G обозначают соответственно поддержку механизма PnP и обслуживание функций энергосбережения (Green Function).

Выполнение стартовых процедур POST из ROM

C0 Запрет External Cache. Запрет Internal Cache. Запрет Shadow RAM. Программирование контроллера DMA, контроллера прерываний, таймера, блока RTC

C1 Определение типа памяти, суммарного объем и размещение по строкам

C3 Проверка первых 256К DRAM для организации Temporary Area. Распаковка BIOS в Temporary Area

C5 Выполняемый код POST переносится в Shadow

C6 Определение присутствия, объема и типа External Cache

C8 Проверка целостности программ и таблиц BIOS

CF Определение типа процессора

Выполнение POST в Shadow RAM

03 Запрет NMI, PIE (Periodic Interrupt Enable), AIE (Alarm Interrupt Enable), UIE (Update Interrupt Enable). Запрет генерации программируемой частоты SQWV

04 Проверка формирования запросов на регенерацию DRAM

05 Проверка и инициализация контроллера клавиатуры

06 Тест области памяти, начинающейся с адреса F000h, где размещен BIOS

07 Проверка функционирования CMOS и батарейного питания

BE Программирование конфигурационных регистров Южного и Северного Мостов

09 Инициализация кэш-памяти L2 и регистров расширенного управления кэшированием процессора Cyrix

0A Генерация таблицы векторов прерываний. Настройка ресурсов Power Management и установка вектора SMI

0B Проверка контрольной суммы CMOS. Сканирование шины PCI устройств. Обновление микрокода процессора

0С Инициализация контроллера клавиатуры

0D Поиск и инициализация видеоадаптера. Настройка IOAPIC. Измерения тактовой частоты, установка FSB

0E Инициализация MPC. Тест видеопамяти. Вывод на экран Award Logo

0F Проверка первого контроллера DMA 8237. Определение клавиатуры и ее внутренний тест. Проверка контрольной суммы BIOS

10 Проверка второго контроллера DMA 8237

11 Проверка страничных регистров контроллеров DMA

14 Тест канала 2 системного таймера

15 Тест регистра маскирования запросов 1-го контроллера прерываний

16 Тест регистра маскирования запросов 2-го контроллера прерываний

19 Проверка пассивности запроса немаскируемого прерывания NMI

30 Определение объема Base Memory и Extended Memory. Настройка APIC. Программное управление режимом Write Allocation

Подготовка таблиц, массивов и структур для старта операционной системы

31 Основной отображаемый на экране тест оперативной памяти. Инициализация

32 Выводится заставка Plug and Play BIOS Extension. Настройка ресурсов Super I/O. Программируется Onboard Audio Device

39 Программирование тактового генератора по шине I2C

3C Установка программного флага разрешения входа в Setup

3D Инициализация PS/2 mouse

3E Инициализации контроллера External Cache и разрешения Cache

BF Настройка конфигурационных регистров чипсета

41 Инициализация подсистемы гибких дисков

42 Отключение IRQ12 если PS/2 mouse отсутствует. Выполняется программный сброс контроллера жестких дисков. Сканирование других IDE устройств

43 Инициализация последовательных и параллельных портов

45 Инициализация сопроцессора FPU

4E Индикация сообщений об ошибках

4F Запрос пароля

50 Восстановление ранее сохраненного в ОЗУ состояния CMOS

51 Разрешение 32 битного доступа к HDD. Настройка ресурсов ISA/PnP

52 Инициализация дополнительных BIOS. Установка значений конфигурационных регистров PIIX. Формирование NMI и SMI

53 Установка счетчика DOS Time в соответствии с Real Time Clock

60 Установка антивирусной защиты BOOT Sector

61 Завершающие действия по инициализации чипсета

62 Чтение идентификатора клавиатуры. Установка ее параметров

63 Коррекция блоков ESCD, DMI. Очистка ОЗУ

FF Передача управления загрузчику. BIOS выполняет команду INT 19h

Рассмотрим процедуру тестирования системного блока персонального компьютера. Установим тестер BM9222 в свободный PCI слот материнской платы. Включим питание. BIOS — программа загрузки компьютера, хранящаяся в ПЗУ материнской платы, производит последовательный опрос всех включенных в системный блок устройств (процессор, модули памяти, винчестер, видеокарта, контроллеры, оптический привод, внешняя периферия: клавиатура мышь и т.д.).

Если все периферийные устройства системного блока исправны, то после окончания загрузки на экране тестера загорится следующая надпись FFh.

«Введем неисправность» в системный блок. Выключим питание и удалим из системного блока модуль памяти.

После подачи питания и загрузки компьютера на экране тестера появляется код ошибки оперативной памяти 4Eh.

Тестер точно определил, что память в системном блоке «неисправна». После выключения питания и возвращения модуля памяти на свое место тестер показал исправность персонального компьютера.

Аналогично можно определить коды ошибок других периферийных устройств и быстро устранить неисправность, заменив неисправный блок на исправный.

Выводы